Användning av Time Lapse mikroskopi för att visualisera Anoxia-inducerad skendöd i<em> C. elegans</em> Embryon
Summary
Beskrivs här är ett<em> In vivo</em> Teknik att avbilda subcellulära strukturer i djur som exponerats för anoxi användning ett gasflöde genom microincubation kammare i samband med en roterande skiva konfokalmikroskop. Denna metod är enkel och tillräckligt flexibel för att passa en mängd olika experimentella parametrar och modellsystem.
Abstract
Caenorhabdits elegans har använts i stor utsträckning i studier av stresstålighet, vilket underlättas av öppenheten i den vuxna och embryo stadier samt av tillgången av genetiska mutanter och transgena stammar som uttrycker en myriad av fusionsproteiner 1-4. Dessutom kan dynamiska processer såsom celldelning visas med fluorescensmärkta reporter proteiner. Studien av mitos kan underlättas genom användning av time-lapse experiment i olika system inklusive intakta organismer, alltså den tidiga C. elegans embryo väl lämpad för denna studie. Presenteras här är en teknik med vilken in vivo avbildning av sub-cellulära strukturer som svar på anoxiska (99,999% N 2, <2 ppm O 2) stress är möjligt med en enkel gasflöde genom installationen på en kraftfull mikroskop. En microincubation kammare används i kombination med kvävgas flöde genom och en roterande skiva konfokalmikroskopatt skapa en kontrollerad miljö där djur kan avbildas in vivo. Använda GFP-märkta gamma tubulin och histon, kan den dynamik och gripandet av celldelning övervakas före, under och efter exponering för en syre-berövade miljö. Resultaten av denna teknik är högupplösta, detaljerade videor och bilder av cellulära strukturer inom blastomerer av embryon utsätts för syrebrist.
Protocol
Representative Results
Discussion
Syrebrist och skendöd
Även exponering för svår syrebrist kan vara dödlig för vissa organismer, vissa organismer kan överleva exponering för anoxi. I fallet av C. elegans, beroende överlevnad anoxi exponering på utvecklingsstadiet och svar på syrebrist är inträde i en reversibel tillstånd av skendöd i vilken ett antal observerbara biologiska processer arresteras. Celldelning, utveckling, rörelse, kost och reproduktiva processer upphöra tills syre återinförs i miljön …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill framföra vår uppskattning för de synpunkter och kommentarer från medlemmar i Padilla Lab. Nematoder stammar i detta arbete lämnades av Caenorhabditis Genetics Center, som finansieras av NIH National Center for Research Resources (NCRR). Vi erkänner och tackar Dr Lon Turnbull för tekniskt bistånd med konfokalmikroskopi. Detta arbete har fått stöd av ett stipendium från National Science Foundation (NSF-IOS, karriär) till PAP
Materials
| Reagents/Equipment | Composition | ||
| Hypochlorite solution | 0.7 g KOH, 12 ml 5% NaOCl, bring to 50 ml with ddH20 | ||
| M9 buffer | 3 g KH2PO4, 11 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml (1 M) MgSO4 per 1 L ddH2O | ||
| Glass microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-343 | 3″x1″x1.0 mm |
| Round micro coverglass | Electron Microscopy Sciences | 72223-01 | 25 mm Diameter |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898-100ml | |
| Anesthetic | 0.5% tricaine, 0.05% tetramisole | ||
| Leiden Closed Perfusion Microincubator | Harvard Apparatus | 650041 | |
| UHP Nitrogen | Calgaz (Air Liquide) | >99.9990% N2 <2 ppm O2 | |
| Plastic tubing | VWR | 89068-468 | 0.062″ ID x 0.125″ OD |
| Spinning Disk Confocal Microscope | McBain Systems | Zeiss inverted optical microscope, epifluorescence illumination system, CSU-10 Yokogawa confocal scanner, Hamamatsu electron multiplier CCD camera. |
References
- Powell-Coffman, J. A. Hypoxia signaling and resistance in C. elegans. Trends Endocrinol. Metab. 21 (10), 435-440 (2010).
- Padilla, P. A., Ladage, M. L. Suspended animation, diapause and quiescence: Arresting the cell cycle in C. elegans. Cell Cycle. 11, (2012).
- Hu, P. J. Dauer. WormBook. , 1-19 (2007).
- Zhou, K. I., Pincus, Z., Slack, F. J. Longevity and stress in Caenorhabditis elegans. Aging (Albany NY). 3, 733-753 (2011).
- Schmidt, D. J., Rose, D. J., Saxton, W. M., Strome, S. Functional analysis of cytoplasmic dynein heavy chain in Caenorhabditis elegans with fast-acting temperature-sensitive mutations. Mol. Biol. Cell. 16, 1200-1212 (2005).
- Sulston, J., Hodgkin, J., Wood, W. B. . The Nematode Caenorhabditis elegans. , 587-606 (1988).
- Padilla, P. A., Nystul, T. G., Zager, R. A., Johnson, A. C., Roth, M. B. Dephosphorylation of Cell Cycle-regulated Proteins Correlates with Anoxia-induced Suspended Animation in Caenorhabditis elegans. Mol. Biol Cell. 13, 1473-1483 (2002).
- Hajeri, V. A., Trejo, J., Padilla, P. A. Characterization of sub-nuclear changes in Caenorhabditis elegans embryos exposed to brief, intermediate and long-term anoxia to analyze anoxia-induced cell cycle arrest. BMC Cell Biol. 6, 1471-2121 (2005).
- Padilla, P. A., Goy, J. M., Hajeri, P. A., Padilla, . Anoxia. , (2012).
- Hajeri, V. A., Little, B. A., Ladage, M. L., Padilla, P. A. NPP-16/Nup50 function and CDK-1 inactivation are associated with anoxia-induced prophase arrest in Caenorhabditis elegans. Mol. Biol. Cell. 21, 712-724 (2010).
- Nystul, T. G., Goldmark, J. P., Padilla, P. A., Roth, M. B. Suspended animation in C. elegans requires the spindle checkpoint. Science. 302, 1038-1041 (2003).
- Margalit, A., Vlcek, S., Gruenbaum, Y., Foisner, R. Breaking and making of the nuclear envelope. J. Cell Biochem. 95, 454-465 (2005).
- Maddox, A. S., Maddox, P. S. High-resolution imaging of cellular processes in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biol. 107, 1-34 (2012).
- Miller, D. L., Roth, M. B. C. elegans are protected from lethal hypoxia by an embryonic diapause. Curr. Biol. 19, 1233-1237 (2009).
