Een<em> In Vitro</em> Voorbereiding voor het uitlokken en opnemen Feeding Motor Programma's met Fysiologische Mutaties in<em> Aplysia californica</em
Summary
We beschrijven een techniek om extracellulair op te nemen en te stimuleren van zenuwen, spieren, en individuele geïdentificeerde neuronen<em> In vitro</em> Terwijl het uitlokken en het observeren van de verschillende soorten van het voeden gedrag in het voedingsapparaat van<em> Aplysia</em>.
Abstract
Multifunctionaliteit, het vermogen van een perifere structuur meerdere, verschillende gedragingen 1 te genereren, kunnen dieren snel hun gedrag passen aan veranderende omstandigheden. De mariene weekdier Aplysia californica biedt een soepel systeem voor de studie van multifunctionaliteit. Tijdens het voeden, Aplysia genereert een aantal verschillende soorten van gedrag met behulp van dezelfde voedselopnameapparaat, de buccale massa. De ganglia die bepalen deze gedragingen bevatten een aantal grote, geïdentificeerde neuronen die toegankelijk zijn voor elektrofysiologische studie. De activiteit van deze neuronen is beschreven in motor's die kunnen worden onderverdeeld in twee types, ingestive en egestive's, gebaseerd op de timing van neurale activiteit die sluit het voedsel grijper ten opzichte van de neurale activiteit die protracts of trekt de grijper 2. Echter in geïsoleerde ganglia, de spierbewegingen die zou produceren deze gedrag afwezig, waardoor hetmoeilijker om zeker of de waargenomen motor programma's correlaten van real gedrag. In vivo, zenuwen en spieren opnamen verkregen overeenkomt met voeren programma 2,3,4, maar het is zeer moeilijk om direct van individuele neuronen 5. Bovendien, in vivo, kan ingestive programma verder worden onderverdeeld in beten en slikt 1,2, een onderscheid dat is moeilijk om in de meeste eerder beschreven in vitro preparaten.
De geschorste buccale massa voorbereiding (figuur 1) overbrugt de kloof tussen geïsoleerde ganglia en intacte dieren. In dit preparaat, ingestive gedrag – zowel bijten en slikken – kan egestive en gedrag (afstoting) worden opgewekt, tegelijk als individuele neuronen kunnen worden opgenomen van en gestimuleerd met extracellulaire elektroden 6. De voeding bewegingen in verband met deze verschillende gedragingen kunnen worden recorded, gekwantificeerd en direct gerelateerd aan de motor programma. De motor programma's in de geschorste buccale massa voorbereiding lijken meer vergelijkbaar met die waargenomen in vivo dan zijn motorische programma's opgewekt in geïsoleerde ganglia. Aldus kan de motor programma in dit preparaat meer rechtstreeks verband houden met in vivo gedrag, tegelijkertijd, individuele neuronen toegankelijk zijn voor opname en stimulatie dan in intacte dieren. Bovendien, als een tussenstap tussen geïsoleerde ganglia en intacte dieren, bevindingen uit de geschorste buccale massa kan helpen bij de interpretatie van de gegevens die zijn verkregen in zowel de meer gereduceerde en meer intact instellingen. De geschorste buccale massa voorbereiding is een nuttig instrument voor het karakteriseren van de neurale aansturing van multifunctionaliteit in Aplysia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eerder werk heeft het kenmerk Aplysia motor's in het intacte dier en in gereduceerde preparaten, zoals geïsoleerde ganglia. In het intacte dier, hoewel opnamen van individuele neuronen zijn verkregen 5, dergelijke experimenten zeer moeilijk en elektroden kan worden verplaatst van neuron tot neuron tijdens het voeden. In geïsoleerde ganglia, kan het voeden van bewegingen veroorzaakt door neurale activiteit niet in acht worden genomen. De geschorste buccale massa voorbereiding overbrugt de kloof …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd ondersteund door NIH subsidie NS047073 en NSF subsidie DMS1010434.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S671 | Biological, Certified |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217 | Certified ACS |
| Magnesium chloride hexahydrate | Acros Organics | 19753 | 99% |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | M63 | Certified ACS |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientifc | C79 | Certified ACS |
| Glucose (dextrose) | Sigma-Aldrich | G7528 | BioXtra |
| MOPS buffer | Acros Organics | 17263 | 99% |
| Carbachol | Acros Organics | 10824 | 99% |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | SS255 | Certified |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | SA49 | Certified |
| Single-barreled capillary glass | A-M Systems | 6150 | |
| Flaming-Brown micropipette puller model P-80/PC | Sutter Instruments | Filament used: FT345B | |
| Enamel coated stainless steel wire | California Fine Wire | 0.001D, coating h | |
| Household Silicone II Glue | GE | ||
| Duro Quick-Gel superglue | Henkel corp. | ||
| A-M Systems model 1700 amplifier | A-M Systems | Filter settings: 300-500 Hz nerves,10-500 Hz I2 muscle | |
| Pulsemaster Multi-Channel Stimulator | World Precision Instruments | A300 | |
| Stimulus Isolator | World Precision Instruments | A360 | |
| AxoGraph X | AxoGraph Scientific | ||
| Veeder-Root Totalizing Counter | Danaher | C342-0562 | |
| Gold Connector Pins | Bulgin | SA3148/1 | |
| Gold Connector Sockets | Bulgin | SA3149/1 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Dow Corning | ||
| 100 x 50 mm Crystalizing Dish | Pyrex | ||
| High Vacuum Grease | Dow Corning | ||
| Pipet Tips | Fisher Scientific | 21-375D | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Modeling Clay | Sargent Art | 22-4400 | |
| Silk Sutures | Ethicon | K89OH | |
| Whisper Air Pump | Tetra | 77849 | |
| Aquarium Tubing | Eheim | 7783 | 12/16 mm |
| Elite Airstone | Hagen | A962 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Yaki Sushi Nori Seaweed | Rhee Bros | ||
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 |
References
- Neustadter, D. M., Herman, R. L., Drushel, R. F., Chestek, D. W., Chiel, H. J. The kinematics of multifunctionality: comparisons of biting and swallowing in Aplysia californica. J. Exp. Biol. 210, 238-260 (2007).
- Morton, D. W., Chiel, H. J. In vivo buccal nerve activity that distinguishes ingestion from rejection can be used to predict behavioral transitions in Aplysia. J. Comp. Physiol. A. 172, 17-32 (1993).
- Hurwitz, I., Neustadter, D., Morton, D. W., Chiel, H. J., Susswein, A. J. Activity patterns of the B31/B32 pattern initiators innervating the I2 muscle of the buccal mass during normal feeding movements in Aplysia californica. J. Neurophys. 75, 1309-1326 (1996).
- Cullins, M. J., Chiel, H. J. Electrode fabrication and implantation in Aplysia californica for multi-channel neural and muscular recordings in intact, freely behaving animals. J. Vis. Exp. (40), e1791 (2010).
- Warman, E. N., Chiel, H. J. A new technique for chronic single extracellular recording in freely behaving animals using pipette electrodes. J. Neurosci. Methods. 57, 161-169 (1995).
- Lu, H., Chestek, C. A., Shaw, K. M., Chiel, H. J. Selective extracellular stimulation of individual neurons in ganglia. J. Neural Eng. 5, 287-309 (2008).
- Church, P. J., Lloyd, P. E. Expression of diverse neuropeptide cotransmitters by identified motor neurons in Aplysia. J. Neurosci. 11, 618-625 (1991).
- Church, P. J., Lloyd, P. E. Activity of multiple identified motor neurons recorded intracellularly during evoked feedinglike motor programs in Aplysia. J. Neurophys. 72, 1794-1809 (1994).
- Nargeot, R. N., Baxter, D. A., Byrne, J. H. Contingent-dependent enhancement of rhythmic motor patterns: an in vitro analog of operant conditioning. J. Neurosci. 17, 8093-8105 (1997).
- Kandel, E. R. . Behavioral biology of Aplysia. , (1979).
- Scott, M. L., Govind, C. K., Kirk, M. D. Neuromuscular organization of the buccal system in Aplysia californica. J. Comp. Neurol. 312, 207-222 (1991).
- Susswein, A. J., Rosen, S. C., Gapon, S., Kupfermann, I. Characterization of buccal motor programs elicited by a cholinergic agonist applied to the cerebral ganglion of Aplysia californica. J. Comp. Physiol. A. 179, 509-524 (1996).
- Kupfermann, I. Feeding behavior in Aplysia: A simple system for the study of motivation. Behav. Biol. 10, 1-26 (1974).
- Morton, D. W., Chiel, H. J. The timing of activity in motor neurons that produce radula movements distinguishes ingestion from rejection in Aplysia. J. Comp. Physiol. A. 173, 519-536 (1993).
- Weiss, K. R., Chiel, H. J., Koch, U., Kupfermann, I. Activity of an identified histaminergic neuron, and its possible role in arousal of feeding behavior in semi-intact Aplysia. J. Neurosci. 6, 2403-2415 (1986).
- Jing, J., Weiss, K. R. Generation of variants of a motor act in a modular and hierarchical motor network. Curr. Biol. 15, 1712-1721 (2005).
- Jing, J., Weiss, K. R. Neural mechanisms of motor program switching in Aplysia. J. Neurosci. 21, 7349-7362 (2001).
- Morgan, P. T., Jing, J., Vilim, F. S., Weiss, K. R. Interneuronal and peptidergic control of motor pattern switching in Aplysia. J. Neurophysiol. 87, 49-61 (2002).
- Jing, J., Cropper, E. C., Hurwitz, I., Weiss, K. R. The construction of movement with behavior-specific and behavior-independent modules. J. Neurosci. 24, 6315-6325 (2004).
