Un<em> In Vitro</em> Preparación para Obtener y grabar programas de alimentación del motor con los movimientos fisiológicos en<em> Aplysia californica</em
Summary
Se describe una técnica para registrar extracelularmente y estimular los nervios, los músculos y las neuronas individuales identificados<em> In vitro</em> Tiempo que se obtiene y la observación de los diferentes tipos de comportamientos de alimentación en el aparato de la alimentación de<em> Aplysia</em>.
Abstract
Multifuncionalidad, la capacidad de una estructura periférica de generar comportamientos múltiples y distintas 1, permite a los animales adaptarse rápidamente su comportamiento a los cambios del entorno. El molusco marino Aplysia californica proporciona un sistema tratable para el estudio de la multifuncionalidad. Durante la alimentación, Aplysia genera varios tipos distintos de comportamientos utilizando el mismo aparato de alimentación, la masa bucal. Los ganglios que controlar estos comportamientos contener un número de neuronas grandes, identificados que son accesibles para el estudio electrofisiológico. La actividad de estas neuronas se ha descrito en los programas motores que se pueden dividir en dos tipos, programas de ingestión y egestive, basado en el tiempo de la actividad neural que se cierra la pinza de agarre de alimentos relativa a la actividad neural que prolonga o se retrae la pinza 2. Sin embargo, en los ganglios aislados, los movimientos musculares que se producen estos comportamientos están ausentes, por lo que esmás difícil estar seguro de si los programas de motores observados son correlatos de los comportamientos reales. En grabaciones vivo, nerviosas y musculares se han obtenido correspondiente a los programas de alimentación 2,3,4, pero es muy difícil de grabar directamente de las neuronas individuales 5. Además, en vivo, programas de ingestión puede ser dividida en picaduras y 1,2 traga, una distinción que es difícil de hacer en la mayoría se ha descrito previamente en preparaciones in vitro.
La preparación de la masa suspendida bucal (Figura 1) cierra la brecha entre los ganglios aislados y animales intactos. En esta preparación, los comportamientos de ingestión – incluyendo tanto mordiendo y tragando – y comportamientos egestive (rechazo) puede ser obtenido, al mismo tiempo, como las neuronas individuales pueden ser grabadas desde y estimulado con electrodos extracelulares 6. Los movimientos de alimentación asociados con estas conductas diferentes puede ser RecorDED, cuantificado y relacionado directamente con los programas motores. Los programas de motor en la preparación de la masa suspendida bucal parecen ser más similares a los observados in vivo que son los programas de motor provocada en los ganglios aislado. Así, los programas de motor en esta preparación puede ser más directamente relacionada con el comportamiento in vivo; al mismo tiempo, las neuronas individuales son más accesibles para registro y estimulación que en los animales intactos. Además, como un paso intermedio entre los ganglios aislado y animales intactos, los hallazgos de la masa suspendida bucal puede ayudar en la interpretación de los datos obtenidos en configuraciones tanto más reducidas y más intacta. La preparación de la masa suspendida bucal es una herramienta útil para caracterizar el control neural de la multifuncionalidad en Aplysia.
Protocol
Representative Results
Discussion
El trabajo previo ha caracterizado Aplysia programas motores en el animal intacto y en preparaciones reducidas, tales como ganglios aislado. En el animal intacto, aunque las grabaciones de las neuronas individuales se han obtenido 5, estos experimentos son muy difíciles, y los electrodos no se puede mover desde una neurona a otra durante la alimentación. En los ganglios aislado, los movimientos de alimentación inducidos por la actividad neural no se puede observar. La preparación de la masa suspe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue financiada por el NIH subvención NS047073 y NSF subvención DMS1010434.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S671 | Biological, Certified |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217 | Certified ACS |
| Magnesium chloride hexahydrate | Acros Organics | 19753 | 99% |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | M63 | Certified ACS |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientifc | C79 | Certified ACS |
| Glucose (dextrose) | Sigma-Aldrich | G7528 | BioXtra |
| MOPS buffer | Acros Organics | 17263 | 99% |
| Carbachol | Acros Organics | 10824 | 99% |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | SS255 | Certified |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | SA49 | Certified |
| Single-barreled capillary glass | A-M Systems | 6150 | |
| Flaming-Brown micropipette puller model P-80/PC | Sutter Instruments | Filament used: FT345B | |
| Enamel coated stainless steel wire | California Fine Wire | 0.001D, coating h | |
| Household Silicone II Glue | GE | ||
| Duro Quick-Gel superglue | Henkel corp. | ||
| A-M Systems model 1700 amplifier | A-M Systems | Filter settings: 300-500 Hz nerves,10-500 Hz I2 muscle | |
| Pulsemaster Multi-Channel Stimulator | World Precision Instruments | A300 | |
| Stimulus Isolator | World Precision Instruments | A360 | |
| AxoGraph X | AxoGraph Scientific | ||
| Veeder-Root Totalizing Counter | Danaher | C342-0562 | |
| Gold Connector Pins | Bulgin | SA3148/1 | |
| Gold Connector Sockets | Bulgin | SA3149/1 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Dow Corning | ||
| 100 x 50 mm Crystalizing Dish | Pyrex | ||
| High Vacuum Grease | Dow Corning | ||
| Pipet Tips | Fisher Scientific | 21-375D | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Modeling Clay | Sargent Art | 22-4400 | |
| Silk Sutures | Ethicon | K89OH | |
| Whisper Air Pump | Tetra | 77849 | |
| Aquarium Tubing | Eheim | 7783 | 12/16 mm |
| Elite Airstone | Hagen | A962 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Yaki Sushi Nori Seaweed | Rhee Bros | ||
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 |
References
- Neustadter, D. M., Herman, R. L., Drushel, R. F., Chestek, D. W., Chiel, H. J. The kinematics of multifunctionality: comparisons of biting and swallowing in Aplysia californica. J. Exp. Biol. 210, 238-260 (2007).
- Morton, D. W., Chiel, H. J. In vivo buccal nerve activity that distinguishes ingestion from rejection can be used to predict behavioral transitions in Aplysia. J. Comp. Physiol. A. 172, 17-32 (1993).
- Hurwitz, I., Neustadter, D., Morton, D. W., Chiel, H. J., Susswein, A. J. Activity patterns of the B31/B32 pattern initiators innervating the I2 muscle of the buccal mass during normal feeding movements in Aplysia californica. J. Neurophys. 75, 1309-1326 (1996).
- Cullins, M. J., Chiel, H. J. Electrode fabrication and implantation in Aplysia californica for multi-channel neural and muscular recordings in intact, freely behaving animals. J. Vis. Exp. (40), e1791 (2010).
- Warman, E. N., Chiel, H. J. A new technique for chronic single extracellular recording in freely behaving animals using pipette electrodes. J. Neurosci. Methods. 57, 161-169 (1995).
- Lu, H., Chestek, C. A., Shaw, K. M., Chiel, H. J. Selective extracellular stimulation of individual neurons in ganglia. J. Neural Eng. 5, 287-309 (2008).
- Church, P. J., Lloyd, P. E. Expression of diverse neuropeptide cotransmitters by identified motor neurons in Aplysia. J. Neurosci. 11, 618-625 (1991).
- Church, P. J., Lloyd, P. E. Activity of multiple identified motor neurons recorded intracellularly during evoked feedinglike motor programs in Aplysia. J. Neurophys. 72, 1794-1809 (1994).
- Nargeot, R. N., Baxter, D. A., Byrne, J. H. Contingent-dependent enhancement of rhythmic motor patterns: an in vitro analog of operant conditioning. J. Neurosci. 17, 8093-8105 (1997).
- Kandel, E. R. . Behavioral biology of Aplysia. , (1979).
- Scott, M. L., Govind, C. K., Kirk, M. D. Neuromuscular organization of the buccal system in Aplysia californica. J. Comp. Neurol. 312, 207-222 (1991).
- Susswein, A. J., Rosen, S. C., Gapon, S., Kupfermann, I. Characterization of buccal motor programs elicited by a cholinergic agonist applied to the cerebral ganglion of Aplysia californica. J. Comp. Physiol. A. 179, 509-524 (1996).
- Kupfermann, I. Feeding behavior in Aplysia: A simple system for the study of motivation. Behav. Biol. 10, 1-26 (1974).
- Morton, D. W., Chiel, H. J. The timing of activity in motor neurons that produce radula movements distinguishes ingestion from rejection in Aplysia. J. Comp. Physiol. A. 173, 519-536 (1993).
- Weiss, K. R., Chiel, H. J., Koch, U., Kupfermann, I. Activity of an identified histaminergic neuron, and its possible role in arousal of feeding behavior in semi-intact Aplysia. J. Neurosci. 6, 2403-2415 (1986).
- Jing, J., Weiss, K. R. Generation of variants of a motor act in a modular and hierarchical motor network. Curr. Biol. 15, 1712-1721 (2005).
- Jing, J., Weiss, K. R. Neural mechanisms of motor program switching in Aplysia. J. Neurosci. 21, 7349-7362 (2001).
- Morgan, P. T., Jing, J., Vilim, F. S., Weiss, K. R. Interneuronal and peptidergic control of motor pattern switching in Aplysia. J. Neurophysiol. 87, 49-61 (2002).
- Jing, J., Cropper, E. C., Hurwitz, I., Weiss, K. R. The construction of movement with behavior-specific and behavior-independent modules. J. Neurosci. 24, 6315-6325 (2004).
