En<em> In Vitro</em> Förberedelser för att framkalla och spela in program Feeding Motor med fysiologiska Rörelser i<em> Aplysia californica</em
Summary
Vi beskriver en teknik för att extracellulärt registrera och stimulera från nerver, muskler och individuellt identifierade nervceller<em> In vitro</em> Medan framkalla och observera olika typer av utfodring beteenden vid utfodring apparaten<em> Aplysia</em>.
Abstract
Multifunktionalitet, förmåga en perifer struktur för att generera flera, distinkta beteenden 1, tillåter djur snabbt anpassa sina beteenden till föränderliga miljöer. Den marina mollusk Aplysia californica ger en lätthanterlig system för studier av multifunktionalitet. Under utfodring genererar Aplysia flera olika typer av beteenden som använder samma matningsanordning, den buckala massan. Den ganglierna som styr dessa beteenden innehåller ett antal stora identifierade, neuroner som är tillgängliga för elektrofysiologiska studier. Aktiviteten hos dessa nervceller har beskrivits i motor program som kan delas in i två typer, ingestive och egestive program, baserat på tidpunkten för neural aktivitet som stänger den relativa mat griparmen till den neurala aktivitet som protracts eller drar tillbaka griparmen 2. Men i isolerad ganglier de muskelrörelser som skulle ge dessa beteenden är frånvarande, vilket gör detsvårare att vara säker på huruvida motorns observerade program är korrelat riktiga beteenden. In vivo, nerv och muskel inspelningar har erhållits motsvarande matning program 2,3,4, men det är mycket svårt att direkt spela in från enskilda neuroner 5. Dessutom in vivo kan ingestive program delas in ytterligare bett och sväljer 1,2, en skillnad som är svår att göra i de flesta tidigare beskrivits in vitro preparat.
Den suspenderade buckala massa preparat (figur 1) överbryggar klyftan mellan isolerade ganglier och intakta djur. I denna beredning ingestive beteenden – inklusive både bita och svälja – kan och egestive beteenden (avvisande) framkallas, samtidigt som enskilda nervceller kan spelas in från och stimuleras att använda extracellulära elektroder 6. Utfodring rörelser i samband med dessa olika beteenden kan RECORded, kvantifieras och direkt relaterade till motorns program. Motorn programmen i suspenderade buckala massa förberedelse verkar vara mer lika dem som observerats in vivo än är motor-program framkallas i isolerade ganglier. Sålunda kan motorn program i denna beredning är mer direkt relaterade till uppträdande in vivo, samtidigt som de enskilda neuroner är mer tillgängliga för inspelning och stimulering än hos intakta djur. Dessutom, som ett mellansteg mellan isolerade ganglier och intakta djur, resultaten från den suspenderade buckala massan kan hjälpa tolkning av data som erhållits i både mer reducerad och mer intakta inställningar. Den suspenderade buckala massa preparat är ett användbart verktyg för att karakterisera neurala kontrollen av multifunktionalitet i Aplysia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tidigare arbete har präglat Aplysia motor program i intakta djur och i minskade preparat, såsom isolerad ganglier. I det intakta djuret, även inspelningar av enskilda neuroner har erhållits 5, sådana experiment är mycket svåra, och elektroder kan inte flyttas från neuron till neuron under matning. I isolerade ganglier kan utfodring rörelser som induceras av neural aktivitet inte observeras. Den suspenderade buckala massa förberedelse överbryggar gapet mellan dessa två ytterligheter.
<…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöddes av NIH bidrag NS047073 och NSF bevilja DMS1010434.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S671 | Biological, Certified |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217 | Certified ACS |
| Magnesium chloride hexahydrate | Acros Organics | 19753 | 99% |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | M63 | Certified ACS |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientifc | C79 | Certified ACS |
| Glucose (dextrose) | Sigma-Aldrich | G7528 | BioXtra |
| MOPS buffer | Acros Organics | 17263 | 99% |
| Carbachol | Acros Organics | 10824 | 99% |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | SS255 | Certified |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | SA49 | Certified |
| Single-barreled capillary glass | A-M Systems | 6150 | |
| Flaming-Brown micropipette puller model P-80/PC | Sutter Instruments | Filament used: FT345B | |
| Enamel coated stainless steel wire | California Fine Wire | 0.001D, coating h | |
| Household Silicone II Glue | GE | ||
| Duro Quick-Gel superglue | Henkel corp. | ||
| A-M Systems model 1700 amplifier | A-M Systems | Filter settings: 300-500 Hz nerves,10-500 Hz I2 muscle | |
| Pulsemaster Multi-Channel Stimulator | World Precision Instruments | A300 | |
| Stimulus Isolator | World Precision Instruments | A360 | |
| AxoGraph X | AxoGraph Scientific | ||
| Veeder-Root Totalizing Counter | Danaher | C342-0562 | |
| Gold Connector Pins | Bulgin | SA3148/1 | |
| Gold Connector Sockets | Bulgin | SA3149/1 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Dow Corning | ||
| 100 x 50 mm Crystalizing Dish | Pyrex | ||
| High Vacuum Grease | Dow Corning | ||
| Pipet Tips | Fisher Scientific | 21-375D | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Modeling Clay | Sargent Art | 22-4400 | |
| Silk Sutures | Ethicon | K89OH | |
| Whisper Air Pump | Tetra | 77849 | |
| Aquarium Tubing | Eheim | 7783 | 12/16 mm |
| Elite Airstone | Hagen | A962 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Yaki Sushi Nori Seaweed | Rhee Bros | ||
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 |
References
- Neustadter, D. M., Herman, R. L., Drushel, R. F., Chestek, D. W., Chiel, H. J. The kinematics of multifunctionality: comparisons of biting and swallowing in Aplysia californica. J. Exp. Biol. 210, 238-260 (2007).
- Morton, D. W., Chiel, H. J. In vivo buccal nerve activity that distinguishes ingestion from rejection can be used to predict behavioral transitions in Aplysia. J. Comp. Physiol. A. 172, 17-32 (1993).
- Hurwitz, I., Neustadter, D., Morton, D. W., Chiel, H. J., Susswein, A. J. Activity patterns of the B31/B32 pattern initiators innervating the I2 muscle of the buccal mass during normal feeding movements in Aplysia californica. J. Neurophys. 75, 1309-1326 (1996).
- Cullins, M. J., Chiel, H. J. Electrode fabrication and implantation in Aplysia californica for multi-channel neural and muscular recordings in intact, freely behaving animals. J. Vis. Exp. (40), e1791 (2010).
- Warman, E. N., Chiel, H. J. A new technique for chronic single extracellular recording in freely behaving animals using pipette electrodes. J. Neurosci. Methods. 57, 161-169 (1995).
- Lu, H., Chestek, C. A., Shaw, K. M., Chiel, H. J. Selective extracellular stimulation of individual neurons in ganglia. J. Neural Eng. 5, 287-309 (2008).
- Church, P. J., Lloyd, P. E. Expression of diverse neuropeptide cotransmitters by identified motor neurons in Aplysia. J. Neurosci. 11, 618-625 (1991).
- Church, P. J., Lloyd, P. E. Activity of multiple identified motor neurons recorded intracellularly during evoked feedinglike motor programs in Aplysia. J. Neurophys. 72, 1794-1809 (1994).
- Nargeot, R. N., Baxter, D. A., Byrne, J. H. Contingent-dependent enhancement of rhythmic motor patterns: an in vitro analog of operant conditioning. J. Neurosci. 17, 8093-8105 (1997).
- Kandel, E. R. . Behavioral biology of Aplysia. , (1979).
- Scott, M. L., Govind, C. K., Kirk, M. D. Neuromuscular organization of the buccal system in Aplysia californica. J. Comp. Neurol. 312, 207-222 (1991).
- Susswein, A. J., Rosen, S. C., Gapon, S., Kupfermann, I. Characterization of buccal motor programs elicited by a cholinergic agonist applied to the cerebral ganglion of Aplysia californica. J. Comp. Physiol. A. 179, 509-524 (1996).
- Kupfermann, I. Feeding behavior in Aplysia: A simple system for the study of motivation. Behav. Biol. 10, 1-26 (1974).
- Morton, D. W., Chiel, H. J. The timing of activity in motor neurons that produce radula movements distinguishes ingestion from rejection in Aplysia. J. Comp. Physiol. A. 173, 519-536 (1993).
- Weiss, K. R., Chiel, H. J., Koch, U., Kupfermann, I. Activity of an identified histaminergic neuron, and its possible role in arousal of feeding behavior in semi-intact Aplysia. J. Neurosci. 6, 2403-2415 (1986).
- Jing, J., Weiss, K. R. Generation of variants of a motor act in a modular and hierarchical motor network. Curr. Biol. 15, 1712-1721 (2005).
- Jing, J., Weiss, K. R. Neural mechanisms of motor program switching in Aplysia. J. Neurosci. 21, 7349-7362 (2001).
- Morgan, P. T., Jing, J., Vilim, F. S., Weiss, K. R. Interneuronal and peptidergic control of motor pattern switching in Aplysia. J. Neurophysiol. 87, 49-61 (2002).
- Jing, J., Cropper, E. C., Hurwitz, I., Weiss, K. R. The construction of movement with behavior-specific and behavior-independent modules. J. Neurosci. 24, 6315-6325 (2004).
