Generering av Human inducerade pluripotenta stamceller från perifert blod Använda STEMCCA lentivirusvektorn

Summary

Här visar vi ett enkelt och effektivt protokoll för generering av humana iPSCs 3 till 4 ml perifert blod med användning av en enda Lentiviral omprogrammering vektor. Omprogrammering av lättillgängliga blodkroppar lovar att påskynda användningen av IPSC tekniken genom att göra det tillgängligt för en bredare forskarsamhället.

Abstract

Genom ektopiskt uttryck av fyra transkriptionsfaktorer, Oct4, Klf4,, Sox2 och cMyc kan humana somatiska celler omvandlas till en pluripotent tillstånd, genererar så kallade inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) ^1-4. Patientspecifika iPSCs saknar de etiska problem som omger embryonala stamceller (ESC) och skulle kringgå eventuella avstötning. Därför har iPSCs fått stor uppmärksamhet för studier sjukdom modellering, screening av farmakologiska föreningar och regenerativa terapier ^5.

Vi har visat att generera transgenen-fria människor iPSCs från patienter med olika lungsjukdomar med en enda punktskattepliktiga polycistronisk Lentiviral kassett Stem Cell (STEMCCA) som kodar för Yamanaka faktorerna ^6. Dessa IPSC linjer genererades från huden fibroblaster, den vanligaste cellen som används för omprogrammering. Normalt erhållande fibroblaster kräver en hud stansbiopsi följt av expansion av cellens i kultur för några passager. Viktigt, har ett antal grupper rapporterat omprogrammering av humana perifera blodceller i iPSCs ^7-9. I en studie, var en Tet inducerbar version av STEMCCA vektorn användes ^9, vilket krävde blodcellerna att samtidigt infekterad med en konstitutivt aktiv lentivirus kodar den omvända tetracyklin transaktivatorn. I motsats till fibroblaster, kan perifera blodceller samlas genom minimalt invasiva procedurer, avsevärt minskar det obehag och ångest hos patienten. En enkel och effektiv protokoll för omprogrammering blodkroppar med en konstitutiv enda punktskattepliktiga vektor kan påskynda tillämpningen av IPSC teknik genom att göra det tillgängligt för en bredare forskarsamhället. Dessutom omprogrammering av perifera blodceller tillåter generering av iPSCs från personer som hudbiopsier bör undvikas (dvs. Avvikande ärrbildning) eller på grund av redan existerande sjukdomstillstånd preventing tillgång till stansbiopsier.

Här visar vi ett protokoll för generering av mänskliga iPSCs från perifera mononukleära blodceller (PBMC) med en enda floxed-punktskattepliktiga lentivirusvektor konstitutivt uttrycker 4 faktorer. Nyligen insamlade eller tinade PBMC expanderas under 9 dagar enligt ^10,11 i medium innehållande askorbinsyra, SCF, IGF-1, IL-3 och EPO innan transducerade med STEMCCA lentivirus. Celler därefter ut på MEF och ESC-liknande kolonier kan visualiseras två veckor efter infektion. Slutligen, är utvalda kloner expanderas och testas för uttryck av de pluripotensbestämmande markörerna SSEA-4, Tra-1-60 och Tra-1-81. Detta protokoll är enkel, robust och mycket konsekvent, ger en tillförlitlig metod för generering av humana iPSCs från lättillgänglig 4 ml blod.

Protocol

1. Isolering och expansion av perifera mononukleära blodceller (PBMC) DAG 0 Rita 4 ml perifert blod i en BD Vacutainer CPT cellberedning Rör med natriumcitrat. Invertera röret 8 till 10 gånger och centrifugera vid 1.800 xg i 30 min vid rumstemperatur. Helst bör detta steg ske inom 2 timmar efter insamling. Samla de mononukleära cellerna (MC) genom pipettering av buffy coat (cellskiktet mellan gelbarriär och plasma) i en steril 15 ml koniskt centrifugrör. Ta den tota…

Representative Results

Vi visar en enkel och effektiv protokoll för generering av humana iPSCs från PBMC med användning av en enda lentivirusvektor. Figur 1A visar en schematisk representation av protokollet. Blodet uppsamlas i en BD Vacutainer CPT cellberedning Rör med natriumcitrat, och efter centrifugering, kan mononukleära celler samlas in från gränsytan mellan polyester gelén och plasman (buffy coat) (Figur 1B). De isolerade PBMC expanderas sedan i odling under 9 dagar. Figur 2 j…

Discussion

Vi beskriver häri användandet av STEMCCA lentivirusvektorn att generera humana iPSCs från mononukleära celler som isolerats från några milliliter nyligen uppsamlat perifert blod. Protokollet kan även användas för att programmera frusna PBMC (erhålls direkt från buffy coat), en detalj av betydande praktiska konsekvenser vid användning donatorceller förvärvats från en avlägsen plats. Innan induktion av omprogrammering måste isolerade PBMC genomgå en kritisk utvidgning steg som gör en frisk förökande p…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
BD Vacutainer CPT Cell Preparation Tube with sodium citrate	BD Biosciences	362760
QBSF-60 Stem Cell Medium	Quality Biological	160-204-101
IMDM	Invitrogen	12440
DMEM/F12	Invitrogen	11330
FBS	Atlanta Biologicals	S10250
Knockout Serum Replacement	Invitrogen	10828
Primocin	Invivogen	ant-pm-2
Pen/Strep	Invitrogen	15140
L-Glutamine	Invitrogen	25030
Non-Essential Amino Acids	Invitrogen	11140
β-mercaptoethanol	MP Biomedicals	190242
Ascorbic Acid	Sigma	A4544
IGF-1	R&D Systems	291-G1
IL-3	R&D Systems	203-IL
SCF	R&D Systems	255-SC
EPO	R&D Systems	286-EP
Dexamethasone	Sigma	D4902
Polybrene	Sigma	H-9268
bFGF	R&D Systems	233-FB
Stemolecule Y27632	Stemgent	04-0012
ES Cell Marker Sample Kit	Millipore	SCR002