Differenziazione Isolamento, caratterizzazione e comparata delle cellule umane Dental Pulp staminali derivate da denti permanenti mediante due diversi metodi

Summary

Il metodo descritto l'isolamento e la caratterizzazione di cellule staminali dentali umane Pulp (hDPSCs) utilizzando<strong> Dissociazione enzimatica della polpa (DPSC-DE)</strong> O<strong> Conseguenza diretta di cellule staminali da espianti di tessuto pulpare (DPSC-OG). Seguito da</strong><em> In vitro</em> Differenziazione comparativa di entrambi i tipi di hDPSCs in odontoblasti.

Abstract

<p class="jove_content"> Denti del giudizio in via di sviluppo sono facilmente accessibile fonte di cellule staminali durante l'età adulta che potrebbe essere ottenuta con trattamenti ortodontici di routine. Umani polpa cellule staminali derivate (hDPSCs) in possesso di un elevato potenziale di proliferazione con il multi-lignaggio capacità di differenziazione confrontare alla fonte ordinaria di cellule staminali adulte^1-8, Quindi, hDPSCs potrebbero essere i candidati ideali per il trapianto autologo in ingegneria dei tessuti e medicina rigenerativa. Oltre a questi benefici, in possesso delle cellule staminali mesenchimali (MSC) offre, come effetti immunolodulatory, hDPSCs rendere più prezioso, anche nel caso di trapianto allogenico^6,9,10. Pertanto, il passaggio principale per utilizzare questa fonte di cellule staminali è quello di selezionare il miglior protocollo per isolare hDPSCs dal tessuto pulpare. Al fine di raggiungere questo obiettivo, è fondamentale per studiare l'effetto delle condizioni di isolamento diverse su differenti comportamenti cellulari, come i loro marcatori di superficie comuni e anche la loro capacità di differenziazione.</p><p class="jove_content"> In questo modo, qui si separano tessuti umani colpiti dalla polpa terzi denti molari, e poi usato entrambi i protocolli esistenti basati sulla letteratura, per hDPSCs isolamento,^11-13<em> Per esempio</em> Dissociazione enzimatica del tessuto pulpare (DPSC-DE) o escrescenza da espianti di tessuto (DPSC-OG). A questo proposito, abbiamo cercato di facilitare i metodi di isolamento mediante disco diamantato dentale. Quindi, queste cellule caratterizzato in termini di stromale associati marcatori (CD73, CD90, CD105 e CD44), pennarelli emopoietiche / endoteliale (CD34, CD45 e CD11b), marcatori perivascolare, come CD146 e anche STRO-1. Successivamente, questi due protocolli sono stati confrontati in base alla potenza differenziazione in odontoblasti sia quantitativa reazione a catena della polimerasi (QPCR) e Alizarin colorazione rossa. QPCR sono stati utilizzati per valutare l'espressione dei geni correlati mineralizzazione (fosfatasi alcalina; ALP, phosphoglycoprotein matrice extracellulare; MEPE & dentina sialophosphoprotein; DSPP).<sup> 14</sup</p

Introduction

Le cellule staminali sono cellule clonogeniche che possiedono due caratteristiche notevoli, conosciuti come multi-potenza e di auto-rinnovamento ^15. Tra tutte le cellule staminali con diverse potenze replicative, le cellule staminali dentali come le cellule staminali post-natali hanno attirato l'attenzione negli ultimi anni, a causa della loro accessibilità, plasticità, e ad alta capacità proliferativa rispetto ad altre cellule staminali adulte ^16. Caratteristicamente, simili alle cellule staminali mesenchimali, cellule staminali polpa dentale sono aderenti cellule clonogeniche aventi capacità multipla differenziazione in mesenchima e / o non-mesenchima lignaggi, sia in vitro che in vivo. ^1-8,17,18 DPSCs sono identificati da la loro espressione negativa di antigeni ematopoietiche (ad esempio, CD45, CD34, CD14), e l'espressione di CD90 positivo, CD29, CD73, CD105, CD44 e STRO-1. ^19,20

Facile potenziale ottenuto con un minimo sforzo e la morbilità rendere DPSCs umani come un validosorgente in grado di MSC rispetto alle fonti ordinarie, come le cellule staminali mesenchimali del midollo ^21. In generale, DPSCs sono stati isolati da una escrescenza metodo, cioè, la migrazione di cellule staminali da espianti di tessuto pulpare (DPSC-OG) ^22-24, e / o mediante digestione enzimatica (DPSC-ED) ^4,6,25. Studi precedenti hanno dimostrato che il metodo di isolamento e condizioni di coltura possono indurre differenti popolazioni o casate sotto passaggi in vitro ^26,27. Nel caso di denti permanenti (pDPSCs), Huang et al rivelato che enzimatiche pDPSCs digeriti hanno potenziale proliferativo superiore rispetto ai DPSCs cresciuti. ²⁶ Inoltre, nel caso di denti decidui (dDPSCs), è stato dimostrato che STRO-1 e CD34 marcatori espressi più dDPSC-DE rispetto a dDPSC-OG. Inoltre, dDPSC-ED visualizzato elevato tasso di mineralizzazione in definito osteo / odonto media. ²⁷ Pertanto, a causa del potenziale eccezionale di DPSCs in rmedicina egenerative, ulteriori studi saranno necessari per una migliore comprensione delle possibili varie popolazioni che sono derivati ​​da diversi metodi di isolamento.

Qui, era tentativo di introdurre modo semplice di estrazione polpa, utilizzando uno step-disco diamantato dentale per facilitare il processo di estrazione polpa. Inoltre, dopo l'isolamento di polpa umani cellule staminali derivate mediante l'applicazione di metodi di ED o OG, proprietà generali e capacità di differenziazione tra i due gruppi sono stati studiati.

Protocol

1. Preparare la soluzione enzimatica e medie proliferazione (PM) Marca Collagenasi I Soluzione: Pesare, collagenasi di tipo I (12 mg / ml) e sciogliere in 1 ml di PBS e filtro con un filtro 0,2 micron siringa. Poi posto 15 ml tubetto e la tiene a -20 ° C fino al momento dell'uso. Fai Soluzione dispasi: Pesare dispasi (16 mg / ml) e sciogliere in 1 ml di PBS e filtro con un filtro 0,2 micron siringa. Poi posto 15 ml tubetto e la tiene a 4 ° C fino al momento de…

Representative Results

DPSCs che sono stati ottenuti dalla dissociazione enzimatica (DPSC-ED) sono mostrati qui a 10 giorni, 15,18 (Figura 1). Le colonie avviato per formare su quasi 3 a 5 giorni dopo l'isolamento. DPSCs superato (DPSC-OG) sono mostrati nella Figura 2, il giorno 5, 10, 13 e 18. Fibroblasto-simili cellule hanno cominciato a migrare dal tessuto pulpare nel pallone da parallelo ordinazione quasi 5 giorni dopo la semina. DPSCs al passaggio 3 utilizzando entrambi i metodi sono illu…

Discussion

Questo protocollo descrive il processo di isolamento e caratterizzazione di hDPSCs da polpa dentale utilizzando due metodi, dissociazione enzimatica e la conseguenza diretta di cellule staminali da espianti di tessuto pulpare. Inoltre, in vitro differenziazione di queste cellule in odontoblasti, è stata valutata mediante dosaggio quantitativo Rosso alizarina S & QPCR.

Protocolli esistenti per isolare dal tessuto pulpare dente umano era stato utilizzato diversi strumenti quali p…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue or Lot. number	Comments (optional)
α-MEM	GIBCO	11900-073
Collagenase type I	Sigma-Aldrich	C0130-100MG
Dispase	GIBCO	17105-041
Penicillin/streptomycin	GIBCO	15140-122
Amphotericin B	GIBCO	15290-018
Fetal Bovine serum defined (FBS)	HyClone	SH30070.03
L-ascorbic acid 2-phosphate	Sigma	A8960-5G
L-glutamine	GIBCO	25030-024
Dexamethasone	Sigma	D4902
β-Glycerol phosphate disodium salt hydrate, BioUltra	Sigma	G9422-100G
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P5655
Osteogenesis Assay Kit	Millipore	PS01802031
Mouse IgG2b-PE isotype control	BD pharmingen	50808088029
FITC mouse IgG2b isotype control	BD pharmingen	559532
FITC mouse IgG1 κ isotype	BD pharmingen	11471471
FITC/PE mouse anti-human CD34/CD45	BD pharmingen	341071
PE anti-human CD146	BD pharmingen	550315
Monoclonal mouse anti-human CD90/FITC	Daka	00034418
PE mouse anti-human CD73	BD pharmingen	550257
Anti-h CD105/Endoglin PE	BD pharmingen	FAB10971P
PE mouse anti-human CD11b/Mac1	BD pharmingen	5553888
CD44 PE mouse anti human	BD pharmingen	555479
Phosphate buffer Solution (PBS)	GIBCO	003000
70-μm cell strainer	Falcon	352360
0.2 μm syringe filter	Millex-GV	SLGV033RB
25 cm2 culture flask	Sigma-Aldrich	Z707481
			EQUIPMENT
BD FACSCalibur	BD	342975
multiskan microplate spectrophotometer	Thermo scientific	51119200
Fleurcense Microscope	Olympus
Flowing Software version 2.3.1