Différenciation isolement, caractérisation et comparative de l'homme dentaires cellules souches de pulpe Dérivé de dents permanentes à l'aide de deux méthodes différentes

Summary

La méthode décrite isolement et la caractérisation de l'homme dentaires cellules souches de pulpe (hDPSCs) en utilisant soit<strongDissociation> enzymatique de la pulpe (DPSC-ED)</strong> Ou<strong> Conséquence directe de cellules souches à partir d'explants de tissus de pulpe (DPSC-OG). Suivie par</strong><em> In vitro</em> Différenciation comparative des deux types de hDPSCs en odontoblastes.

Abstract

<p class="jove_content"> Les dents de sagesse en développement sont faciles d'accès source de cellules souches au cours de l'âge adulte qui pourrait être obtenu par routine traitements orthodontiques. Les cellules souches dérivées de la pâte (hDPSCs) possèdent un potentiel de prolifération élevé avec une capacité de différenciation de lignées multiples comparer à la source ordinaire de cellules souches adultes^08.01 Et, par conséquent, hDPSCs pourraient être les bons candidats pour une transplantation autologue dans l'ingénierie tissulaire et la médecine régénérative. En plus de ces avantages, possédant les cellules souches mésenchymateuses (CSM) les caractéristiques, telles que l'effet immunolodulatory, assurez-hDPSCs plus précieux, même dans le cas de la transplantation d'allogreffes^6,9,10. Par conséquent, la première étape de l'utilisation de cette source de cellules souches est de choisir le meilleur protocole pour isoler hDPSCs du tissu pulpaire. Pour atteindre cet objectif, il est essentiel d'étudier l'effet de diverses conditions d'isolement sur les différents comportements cellulaires, tels que les marqueurs de surface communs et aussi leur capacité de différenciation.</p><p class="jove_content"> Ainsi, ici nous séparer pulpe humaine touchées troisième molaires, puis utilisé deux protocoles existants sur la base de la littérature, pour hDPSCs isolement,^11-13<em> Ie</em> Dissociation enzymatique du tissu pulpaire (DPSC-ED) ou excroissance à partir d'explants de tissus (DPSC-OG). À ce sujet, nous avons essayé de faciliter les méthodes d'isolement en utilisant le disque de diamant dentaire. Ensuite, ces cellules caractérisées en termes de stromales associées Marqueurs (CD73, CD90, CD105 et CD44), marqueurs hématopoïétiques / endothéliales (CD34, CD45 et CD11b), marqueur périvasculaire, comme CD146 et aussi STRO-1. Par la suite, ces deux protocoles ont été comparés en fonction de la puissance de différenciation en odontoblastes fois par la réaction en chaîne par polymérase quantitative (qPCR) et rouge d'alizarine coloration. QPCR ont été utilisés pour l'évaluation de l'expression des gènes liés à la minéralisation (phosphatase alcaline; ALP, matrice extracellulaire phosphoglycoprotéine; MEPE et la dentine sialophosphoprotéine; DSPP).<sup> 14</sup</p

Introduction

Les cellules souches sont des cellules clonogéniques qui possèdent deux caractéristiques remarquables, appelés multi-activité et l'auto-renouvellement ^15. Parmi toutes les cellules souches avec des puissances différentes réplicatifs, les cellules souches dentaires comme les cellules souches postnatales ont attiré l'attention ces dernières années en raison de leur accessibilité, la plasticité et haute capacité de prolifération en comparaison avec d'autres cellules souches adultes ^16. De façon caractéristique, similaire aux cellules souches mésenchymateuses, cellules souches dentaires de pâte à papier sont adhérentes des cellules clonogéniques qui ont la capacité de différenciation multiple dans le mésenchyme et / ou non-mésenchyme lignées, à la fois in vitro et in vivo. ^1-8,17,18 DPSC sont identifiés par leur expression négative d'antigènes hématopoïétiques (par exemple, CD45, CD34, CD14), et l'expression positive de CD90, CD29, CD73, CD105, CD44 et STRO-1. ^19,20

Facile potentiel obtenu avec un minimum de douleur et de morbidité faire DPSC de l'homme comme un précieuxsource de pouvoir des CSM par rapport aux sources ordinaires, telles que les cellules souches de la moelle osseuse mésenchymateuses ^21. En général, DPSC ont été isolés par les deux méthodes conséquence, c'est à dire, la migration des cellules souches à partir d'explants de tissu pulpaire (DPSC-OG) ^22-24, et / ou par digestion enzymatique (DPSC-ED) ^4,6,25. Des études antérieures ont montré que la méthode d'isolement et des conditions de culture peut induire différentes populations ou lignées en vertu passages in vitro ^26,27. Dans le cas des dents permanentes (pDPSCs), Huang et al révélé que enzymatiques pDPSCs digérés ont un potentiel plus élevé par rapport à la prolifération des DPSC trop grands. ^{26 En} outre, dans le cas des dents de lait (dDPSCs), il a été démontré que STRO-1 et CD34 marqueurs exprimés plus dDPSC-ED en comparaison avec dDPSC-OG. En outre, dDPSC-ED affiché taux plus élevé de minéralisation dans définis ostéo / odonto moyen ^27. Par conséquent, en raison du potentiel exceptionnel de DPSC dans regenerative médecine, d'autres études seront nécessaires pour mieux comprendre les éventuelles différentes populations qui sont issus de différentes méthodes d'isolement.

Ici, c'était tentative d'introduire facilement de l'extraction de la pâte, à l'aide d'un disque diamanté étape dentaire afin de faciliter le processus d'extraction de la pâte. En outre, après l'isolement des cellules souches dérivées de la pâte en appliquant les méthodes ED ou OG, les propriétés générales et la capacité de différenciation entre les deux groupes ont également été étudiés.

Protocol

1. Préparer la solution enzymatique et moyennes prolifération (PM) Assurez-collagénase de type I Solution: Peser la collagénase de type I (12 mg / ml) et dissoudre dans 1 ml de PBS et le filtre à l'aide d'un filtre de 0,2 um seringue. Puis placez-le tube de 15 ml et le garder à -20 ° C jusqu'à ce que nécessaire. Assurez-dispase Solution: Peser dispase (16 mg / ml) et dissoudre dans 1 ml de PBS et le filtre à l'aide d'un filtre de 0,2 um…

Representative Results

DPSC qui ont été obtenus par dissociation enzymatique (DPSC-ED) sont présentés ici au jour 10, 15,18 (figure 1). Les colonies engagées à se former sur près de 3 à 5 jours après l'isolement. DPSC trop grands (DPSC-OG) sont présentés dans la figure 2 au jour 5, 10, 13 et 18. Fibroblast-like cellules ont commencé à migrer à partir de pulpe dans le ballon par commande parallèle de près de 5 jours après le semis. DPSC au passage 3 en utilisant les deux métho…

Discussion

Ce protocole décrit le processus d'isolement et la caractérisation de hDPSCs de la pulpe dentaire en utilisant deux méthodes, la dissociation enzymatique et excroissance directe de cellules souches à partir d'explants de tissus de pulpe. En outre, la différenciation in vitro de ces cellules en odontoblastes, a été évaluée par dosage quantitatif Rouge d'alizarine S & QPCR.

Les protocoles existants pour isoler le tissu pulpaire de la dent humaine avai…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue or Lot. number	Comments (optional)
α-MEM	GIBCO	11900-073
Collagenase type I	Sigma-Aldrich	C0130-100MG
Dispase	GIBCO	17105-041
Penicillin/streptomycin	GIBCO	15140-122
Amphotericin B	GIBCO	15290-018
Fetal Bovine serum defined (FBS)	HyClone	SH30070.03
L-ascorbic acid 2-phosphate	Sigma	A8960-5G
L-glutamine	GIBCO	25030-024
Dexamethasone	Sigma	D4902
β-Glycerol phosphate disodium salt hydrate, BioUltra	Sigma	G9422-100G
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P5655
Osteogenesis Assay Kit	Millipore	PS01802031
Mouse IgG2b-PE isotype control	BD pharmingen	50808088029
FITC mouse IgG2b isotype control	BD pharmingen	559532
FITC mouse IgG1 κ isotype	BD pharmingen	11471471
FITC/PE mouse anti-human CD34/CD45	BD pharmingen	341071
PE anti-human CD146	BD pharmingen	550315
Monoclonal mouse anti-human CD90/FITC	Daka	00034418
PE mouse anti-human CD73	BD pharmingen	550257
Anti-h CD105/Endoglin PE	BD pharmingen	FAB10971P
PE mouse anti-human CD11b/Mac1	BD pharmingen	5553888
CD44 PE mouse anti human	BD pharmingen	555479
Phosphate buffer Solution (PBS)	GIBCO	003000
70-μm cell strainer	Falcon	352360
0.2 μm syringe filter	Millex-GV	SLGV033RB
25 cm2 culture flask	Sigma-Aldrich	Z707481
			EQUIPMENT
BD FACSCalibur	BD	342975
multiskan microplate spectrophotometer	Thermo scientific	51119200
Fleurcense Microscope	Olympus
Flowing Software version 2.3.1