Diferenciación de aislamiento, caracterización y comparativo de las células madre derivadas de la Pulpa Dental de los dientes permanentes mediante dos métodos diferentes

Summary

El método se describe el aislamiento y caracterización de células humanas de la Pulpa Dental madre (hDPSCs) mediante el uso de cualquiera de los dos<strong> Disociación enzimática de la pulpa (DPSC-ED)</strong> O<strong> Consecuencia directa de las células madre a partir de explantes de tejido pulpar (DPSC-OG). A continuación, seguido por</strong><em> In vitro</em> Diferenciación comparativo de ambos tipos de hDPSCs en odontoblastos.

Abstract

<p class="jove_content"> Desarrollo de las muelas del juicio son de fácil acceso fuente de células madre durante la edad adulta que se podría obtener por la rutina de tratamientos de ortodoncia. Humanos derivados de células madre de pulpa (hDPSCs) poseen potencial de proliferación de altura con capacidad de diferenciación multi-linaje comparar con el origen común de las células madre adultas^1-8, Por lo tanto, podría ser hDPSCs los buenos candidatos para el trasplante autólogo en ingeniería de tejidos y la medicina regenerativa. Junto con estas ventajas, que posea las células madre mesenquimales (MSC) características, tales como el efecto immunolodulatory, hacer hDPSCs más valioso, incluso en el caso de trasplante de aloinjerto^6,9,10. Por lo tanto, el primer paso para el uso de esta fuente de células madre es seleccionar el mejor protocolo para aislar hDPSCs de tejido de la pulpa. Con el fin de lograr este objetivo, es crucial para investigar el efecto de diferentes condiciones de aislamiento en diferentes comportamientos celulares, tales como sus marcadores de superficie comunes y también su capacidad de diferenciación.</p><p class="jove_content"> Por lo tanto, aquí nos separamos tejido pulpar humano a partir de los terceros molares, y después utilizar ambos protocolos existentes basados ​​en la literatura, por hDPSCs aislamiento,^11-13<em> Es decir,</em> Disociación enzimática del tejido pulpar (DPSC-ED) o la extensión de explantes de tejidos (DPSC-OG). En este aspecto, hemos tratado de facilitar los métodos de aislamiento mediante disco de diamante dentales. Entonces, estas células se caracteriza en términos de estroma marcadores asociados (CD73, CD90, CD105 y CD44), marcadores hematopoyéticos / endotelial (CD34, CD45 y CD11b), marcador perivascular, como CD146 y también STRO 1-. Después, estos dos protocolos se compararon sobre la base de la potencia diferenciación en odontoblastos tanto por reacción en cadena de la polimerasa (QPCR) y tinción Rojo de alizarina. QPCR se utilizaron para la evaluación de la expresión de los genes relacionados con la mineralización-(fosfatasa alcalina; ALP, phosphoglycoprotein matriz extracelular; MEPE y dentina sialophosphoprotein; DSPP).<sup> 14</sup</p

Introduction

Las células madre son células clonigénicas que poseen dos características notables, conocidas como multi-potencia y auto-renovación ^15. Entre todas las células madre con potencias diferentes replicativos, las células madre dentales como las células madre postnatales han llamado la atención en los últimos años debido a su accesibilidad, la plasticidad y alta capacidad proliferativa en comparación con otras células madre adultas ^16. Característicamente, similar a las células madre mesenquimales, células madre de pulpa dental están adheridas las células clonogénicas que tienen la capacidad de diferenciación en múltiples mesénquima y / o no-mesénquima linajes, tanto in vitro como in vivo. ^1-8,17,18 DPSCs se identifican por su expresión negativa de antígenos hematopoyéticos (por ejemplo, CD45, CD34, CD14), y la expresión positiva de CD90, CD29, CD73, CD105, CD44 y STRO ^1-19,20.

Fácil potencial obtenida con un mínimo de dolor y morbilidad hacer DPSCs humanos como una valiosafuente capaz de MSCs en comparación con las fuentes comunes, tales como células madre mesenquimales de la médula ósea ^21. En general, DPSCs se han aislado por cualquier método de derivación, es decir, la migración de las células madre a partir de explantes de tejido de pulpa (DPSC-OG) ^22-24, y / o mediante digestión enzimática (DPSC-ED) ^4,6,25. Estudios anteriores han demostrado que el método de aislamiento y las condiciones de cultivo pueden inducir diferentes poblaciones o linajes bajo pasajes in vitro ^26,27. En el caso de los dientes permanentes (pDPSCs), Huang et al puesto de manifiesto que enzimáticas pDPSCs digeridos tienen un mayor potencial de proliferación en comparación con los DPSCs superado. ²⁶ Por otra parte, en el caso de los dientes deciduos (dDPSCs), se demostró que STRO-1 y CD34 marcadores expresa más en DDPSC-DE en comparación con DDPSC-OG. Además, DDPSC-ED mostraron un aumento significativo en la tasa de mineralización definida osteo / odonto medio. ²⁷ Por lo tanto, debido al gran potencial de DPSCs en regenerative medicina, más estudios se requerirán para un mejor entendimiento de las posibles poblaciones diferentes que se derivan de diferentes métodos de aislamiento.

Aquí, era intento de introducir de manera fácil extracción de la pulpa, mediante el uso de un solo paso disco de diamante dental para facilitar el proceso de extracción de la pulpa. Por otra parte, tras el aislamiento de las células madre derivadas de la pulpa mediante la aplicación de métodos o ED OG, propiedades generales y capacidad de diferenciación entre dos grupos también fueron investigados.

Protocol

1. Preparar la solución de enzima y medio de proliferación (PM) Hacer colagenasa tipo I Solución: Pesar colagenasa tipo I (12 mg / ml) y se disuelven en 1 ml de PBS y el filtro utilizando un filtro de 0,2 micras jeringa. A continuación, colóquelo tubo de 15 ml y conservarse a -20 ° C hasta su utilización. Hacer la solución de dispasa: Pesar dispasa (16 mg / ml) y se disuelven en 1 ml de PBS y el filtro utilizando un filtro de 0,2 micras jeringa. A continuaci…

Representative Results

DPSCs que fueron obtenidos por disociación enzimática (DPSC-ED) se muestran aquí, en días 10, 15,18 (Figura 1). Las colonias iniciados para formar en casi 3 a 5 días después del aislamiento. DPSCs superado (DPSC-OG) se muestran en la Figura 2 en el día 5, 10, 13 y 18. Similares a fibroblastos células comenzaron a migrar de tejido de la pulpa en el matraz por paralelo ordenar por casi 5 días después de la siembra. DPSCs en el paso 3 con ambos métodos se muestran en…

Discussion

Este protocolo describe el proceso de aislamiento y caracterización de hDPSCs de pulpa dental utilizando dos métodos, la disociación enzimática y la consecuencia directa de las células madre a partir de explantes de tejido de la pulpa. Además, la diferenciación in vitro de estas células en odontoblastos, se evaluó por el ensayo cuantitativo rojo de alizarina S & QPCR.

Los protocolos existentes para el aislamiento de tejido de la pulpa de los dientes humanos se …

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue or Lot. number	Comments (optional)
α-MEM	GIBCO	11900-073
Collagenase type I	Sigma-Aldrich	C0130-100MG
Dispase	GIBCO	17105-041
Penicillin/streptomycin	GIBCO	15140-122
Amphotericin B	GIBCO	15290-018
Fetal Bovine serum defined (FBS)	HyClone	SH30070.03
L-ascorbic acid 2-phosphate	Sigma	A8960-5G
L-glutamine	GIBCO	25030-024
Dexamethasone	Sigma	D4902
β-Glycerol phosphate disodium salt hydrate, BioUltra	Sigma	G9422-100G
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P5655
Osteogenesis Assay Kit	Millipore	PS01802031
Mouse IgG2b-PE isotype control	BD pharmingen	50808088029
FITC mouse IgG2b isotype control	BD pharmingen	559532
FITC mouse IgG1 κ isotype	BD pharmingen	11471471
FITC/PE mouse anti-human CD34/CD45	BD pharmingen	341071
PE anti-human CD146	BD pharmingen	550315
Monoclonal mouse anti-human CD90/FITC	Daka	00034418
PE mouse anti-human CD73	BD pharmingen	550257
Anti-h CD105/Endoglin PE	BD pharmingen	FAB10971P
PE mouse anti-human CD11b/Mac1	BD pharmingen	5553888
CD44 PE mouse anti human	BD pharmingen	555479
Phosphate buffer Solution (PBS)	GIBCO	003000
70-μm cell strainer	Falcon	352360
0.2 μm syringe filter	Millex-GV	SLGV033RB
25 cm2 culture flask	Sigma-Aldrich	Z707481
			EQUIPMENT
BD FACSCalibur	BD	342975
multiskan microplate spectrophotometer	Thermo scientific	51119200
Fleurcense Microscope	Olympus
Flowing Software version 2.3.1