Isolasjon, karakterisering og Comparative Differensiering av Human tannpulpa stamceller hentet fra permanente tenner ved hjelp av to ulike metoder

Summary

Metoden er beskrevet isolering og karakterisering av menneskelig tannpulpa stamceller (hDPSCs) ved hjelp av enten<strong> Enzymatisk dissosiasjon av papirmasse (DPSC-ED)</strong> Eller<strong> Direkte resultat av stamceller fra pulpavevet explants (DPSC-OG). Deretter fulgt av</strong><em> In vitro</em> Sammenlignende differensiering av begge typer hDPSCs inn odontoblaster.

Abstract

<p class="jove_content"> Utvikle visdomstennene er enkle tilgjengelige kilde til stamceller under voksenlivet som kunne oppnås ved rutinemessige kjeveortopedisk behandling. Menneskelige pulp-avledet stamceller (hDPSCs) har høy spredning potensial med multi-avstamning differensiering kapasitet i forhold til den ordinære kilden voksne stamceller^1-8, Og derfor kan hDPSCs være gode kandidater for autolog transplantasjon i tissue engineering og regenerativ medisin. Sammen med disse fordeler, innehar mesenchymale stamceller (MSC) funksjoner, slik som immunolodulatory effekt, gjør hDPSCs mer verdifull, selv i tilfelle av allograft transplantasjon^6,9,10. Derfor, er det primære trinnet for bruk av denne kilde til stamceller for å velge den beste protokollen for å isolere hDPSCs fra pulpavevet. For å oppnå dette målet, er det avgjørende å undersøke effekten av ulike isolasjon forhold på ulike cellulære atferd, for eksempel deres felles overflate markører og også deres differensiering kapasitet.</p><p class="jove_content"> Derfor, her vi skiller mennesker pulpavevet fra påvirket tredje molar tenner, og deretter brukt både eksisterende protokoller basert på litteratur, for å isolere hDPSCs,^11-13<em> Dvs.</em> Enzymatisk dissosiasjon av pulpavevet (DPSC-ED) eller utvekst fra vev explants (DPSC-OG). I denne forbindelse, prøvde vi å legge til rette for isolasjon metoder ved hjelp av dental diamant disk. Deretter disse cellene preget i form av stromal-tilknyttede Markers (CD73, CD90, CD105 og CD44), blodkreft / endothelial markører (CD34, CD45 og CD11b), perivaskulær markør, som CD146 og også STRO-1. Etterpå ble disse to protokollene sammenlignet basert på differensiering styrke i odontoblaster både kvantitative polymerase chain reaction (QPCR) og Alizarin Red Farging. QPCR ble brukt for vurdering av uttrykket av mineralisering-relaterte gener (alkalisk fosfatase, ALP, matrix ekstracellulært phosphoglycoprotein, MEPE & dentin sialophosphoprotein, DSPP).<sup> 14</sup</p

Introduction

Stamceller er clonogenic celler som besitter to bemerkelsesverdige funksjoner, kjent som multi-styrke og selvfornyelse ^15. Blant alle stamceller med ulike replicative potencies, har dental stamceller som de postnatal stamceller trukket oppmerksomhet de siste årene på grunn av sin tilgjengelighet, plastisitet, og høy proliferativ evne sammenlignet med andre voksne stamceller ^16. Karakteristisk, ligner på stamceller, dental pulp stamceller er adherente clonogenic celler som har multippel differensiering kapasitet inn mesenchyme og / eller ikke-mesenchyme linjene, både in vitro og in vivo. ^1-8,17,18 DPSCs identifiseres ved deres negative uttrykk for blodkreft antigener (f.eks CD45, CD34, CD14), og positive uttrykk for CD90, CD29, CD73, CD105, CD44 og STRO-1. ^19,20

Enkel innhentet potensial med minimum smerte og sykelighet gjør menneskelige DPSCs som verdifullestand kilde MSCS forhold til ordinær kilder, for eksempel benmarg stamceller ^21. Generelt har DPSCs blitt isolert ved enten utvekst metode, dvs. migrering av stamceller fra pulpavevet eksplanter (DPSC-OG) ^22-24, og / eller ved enzymatisk fordøyelse (DPSC-ED) ^4,6,25. Tidligere studier har vist at den isolasjon metoden og dyrkningsbetingelser kan indusere forskjellige populasjoner eller linjene under i vitro passasjer ^26,27. I tilfelle av permanente tenner (pDPSCs), avslørte Huang et al at enzymatiske fordøyd pDPSCs har høyere spredning potensiale sammenlignet med de vokst DPSCs. ²⁶ Videre, i tilfelle av melketenner (dDPSCs), ble det vist at STRO-1 & CD34 markører uttrykkes mer i dDPSC-ED sammenlignet med dDPSC-OG. I tillegg, viste dDPSC-ED høyere mineralisering rate i definerte osteo / odonto medium. ²⁷ Derfor, på grunn av den enestående potensialet DPSCs i regenerative medisin, vil flere studier være nødvendig for bedre forståelse av mulige ulike populasjoner som er utledet fra ulike isolasjon metoder.

Her var det forsøk på å innføre enkel måte papirmasse ekstraksjon, ved å bruke en-trinns dental diamant disk å forenkle prosessen med papirmasse utvinning. Dessuten, etter isolering av humane papirmasse-avledede stamceller ved å bruke ED eller OG metoder ble generelle egenskaper og differensiering kapasitet mellom to grupper også undersøkt.

Protocol

1. Forbered Enzyme Solution og spredning Medium (PM) Merke collagenase Type I Løsning: Vei opp kollagenase type I (12 mg / ml) og oppløses i 1 ml PBS og filteret med en 0,2 um sprøytefilter. Deretter plasserer den 15 ml tube og holde det ved -20 ° C inntil nødvendig. Merke dispase Løsning: Vei opp dispase (16 mg / ml) og oppløses i 1 ml PBS og filteret med en 0,2 um sprøytefilter. Deretter plasserer den 15 ml tube og holde den ved 4 ° C inntil nødvendig. <…

Representative Results

DPSCs som ble innhentet ved enzymatisk dissosiasjon (DPSC-ED) er vist her på 10 dag, 15,18 (figur 1). Koloniene iverksatt for å danne på nesten 3 til 5 dager etter isolasjon. Outgrown DPSCs (DPSC-OG) er vist i figur 2 på 5 dag, 10, 13 & 18. Fibroblast-lignende celler begynte å migrere fra pulpavevet i flaska ved parallelle bestilling av nesten 5 dager etter såing. DPSCs på passasjen 3 med begge metoder er vist i figur 3.. Begge typer DPSCs var nesten i sa…

Discussion

Denne protokollen beskriver prosessen med isolering og karakterisering av hDPSCs fra tannpulpa ved hjelp av to metoder, enzymatisk dissosiasjon og direkte resultat av stamceller fra pulpavevet explants. I tillegg, i vitro differensiering av disse cellene til odontoblaster, ble vurdert av kvantitativ Alizarin Red S analysen & QPCR.

Eksisterende protokoller for å isolere pulpavevet fra menneskelig tann hadde blitt brukt ulike instrumenter som tang (bein tang) 9, utryddelsen ^…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue or Lot. number	Comments (optional)
α-MEM	GIBCO	11900-073
Collagenase type I	Sigma-Aldrich	C0130-100MG
Dispase	GIBCO	17105-041
Penicillin/streptomycin	GIBCO	15140-122
Amphotericin B	GIBCO	15290-018
Fetal Bovine serum defined (FBS)	HyClone	SH30070.03
L-ascorbic acid 2-phosphate	Sigma	A8960-5G
L-glutamine	GIBCO	25030-024
Dexamethasone	Sigma	D4902
β-Glycerol phosphate disodium salt hydrate, BioUltra	Sigma	G9422-100G
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P5655
Osteogenesis Assay Kit	Millipore	PS01802031
Mouse IgG2b-PE isotype control	BD pharmingen	50808088029
FITC mouse IgG2b isotype control	BD pharmingen	559532
FITC mouse IgG1 κ isotype	BD pharmingen	11471471
FITC/PE mouse anti-human CD34/CD45	BD pharmingen	341071
PE anti-human CD146	BD pharmingen	550315
Monoclonal mouse anti-human CD90/FITC	Daka	00034418
PE mouse anti-human CD73	BD pharmingen	550257
Anti-h CD105/Endoglin PE	BD pharmingen	FAB10971P
PE mouse anti-human CD11b/Mac1	BD pharmingen	5553888
CD44 PE mouse anti human	BD pharmingen	555479
Phosphate buffer Solution (PBS)	GIBCO	003000
70-μm cell strainer	Falcon	352360
0.2 μm syringe filter	Millex-GV	SLGV033RB
25 cm2 culture flask	Sigma-Aldrich	Z707481
			EQUIPMENT
BD FACSCalibur	BD	342975
multiskan microplate spectrophotometer	Thermo scientific	51119200
Fleurcense Microscope	Olympus
Flowing Software version 2.3.1