باستخدام الحمض النووي الريبي التي تتوسط استراتيجية التغذية التدخل للكشف عن الجينات المسؤولة عن تنظيم حجم الجسم في نيماتودا<em> C. ايليجانس</em
Summary
نحن لشرح كيفية استخدام تقنية التغذية رني لاسقاط الجينات المستهدفة والنمط الظاهري نقاط حجم الجسم في<em> C. ايليجانس</em>. ويمكن استخدام هذه الطريقة لشاشة نطاق واسع لتحديد المكونات الجينية محتمل في المصالح، مثل تلك التي تشارك في تنظيم حجم الجسم عن طريق إشارات DBL-1/TGF-β.
Abstract
RNA المزدوج حبلا بوساطة التدخل (رني) هو استراتيجية فعالة لاسقاط الهدف الجين 1-3 التعبير. وقد تم تطبيق النموذج على الأنظمة بما في ذلك العديد من اللافقاريات والنباتات والفقاريات. هناك طرق مختلفة لتحقيق رني 4،5 في الجسم الحي. على سبيل المثال، قد يتم تحويل الجينات المستهدفة إلى ناقلات رني، ومن ثم إما بشكل دائم أو عابر تحويلها إلى خطوط الخلية أو الخلايا الأولية لتحقيق تأثيرات الجينات ضربة قاضية، وقد توليفها بدلا من مزدوج الجديلة أليغنوكليوتيد] من الجينات المستهدفة محددة (رني oligos) تكون عابر ويمكن تصنيعه أو microinjected المزدوج حبلا جزيئات الحمض النووي الريبي في الكائن الحي؛ تحويلها إلى خطوط الخلية أو الخلايا الأولية لإسكات الجينات المستهدفة. منذ C. الديدان الخيطية ايليجانس يستخدم البكتيريا كمصدر للغذاء، وإطعام الحيوانات مع البكتيريا معربا عن نقرا مزدوجا حبلا الحمض النووي الريبي الجينات المستهدفة ضد يوفر استراتيجية قابلة للتطبيق 6. هنا نقدم لتغذية رنيطريقة الجسم ليسجل حجم النمط الظاهري. حجم الجسم في C. وينظم ايليجانس في المقام الأول من قبل TGF-β – يجند مثل DBL-1، لذلك هذا الاختبار هو المناسب لتحديد TGF-β مكونات يشير 7. كنا سلالات مختلفة بما في ذلك سلالات شديدة الحساسية 2 رني لتكرار التجارب التغذية رني. وأظهرت النتائج أن قوة الرد السريع دينا-3 سلالة قدم لنا أفضل النمط الظاهري رني المتوقعة. هذه الطريقة سهلة لتنفيذ، واستنساخه، وكميا بسهولة. وعلاوة على ذلك، لدينا بروتوكول يقلل من استخدام المعدات المتخصصة، لذلك هي مناسبة لأصغر المختبرات أو في المؤسسات الجامعية التي في الغالب.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا البروتوكول، ونحن لدينا وصف طريقة لتحديد حجم الجسم المسوخ معيبة من C. ايليجانس بواسطة رني التغذية. هذه الطريقة تنطبق على تحديد مكونات الإشارات TGF-β. من الحفظ للغاية منذ هذه المكونات من خلال التطور 15، شاشات ذات الصلة مثل توضيح الآليات الجزيئية للإشارات…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر جيمس كلارك لتقديم شخصيات من الحيوانات في مختلف نقاط زمنية التنموية. C. تم الحصول على سلالات ايليجانس في هذه الدراسة من مركز علم الوراثة Caenorhabditis، وهو مدعوم من قبل المركز الوطني لبحوث الموارد NIH (NCRR). وأيد هذا العمل من قبل 1817 من جامعة مدينة نيويورك CIRG لJL وCSD، والمعاهد الوطنية للصحة و1R15GM073678-01-01 1R15GM097692 لجنة التنمية المستدامة ونحن نشكر الدكتور ويليام J رايس، والدكتور ناتاليا هولتزمان، وسيلفستريني ميليسا للتعليقات على المخطوط. تم تنفيذ هذا العمل في التنفيذ الجزئي فقط من متطلبات للحصول على درجة الدكتوراه من مركز الدراسات العليا التابع لجامعة مدينة نيويورك (S. شيونغ).
Materials
| RNAi worm plates 17.7 g Worm Medium Mix 60 g Agar Add H2O to 3 liters. Autoclave. Add 3 ml 1M IPTG(sterile) and 3 ml 25 mg/ml Carbenicillin(sterile); then pour into 60 mm Petri dishes. Worm plates 17.7 g Worm Medium Mix 0.6 g Streptomycin Sulfate 60 g Agar Add H2O to 3 liters. Autoclave. Pour into 60 mm Petri dishes. Worm Medium Mix 55 g Tris-Cl 24 g Tris-OH 310 g Bacto Peptone 800 mg Cholesterol 200 g NaCl Mix thoroughly and be sure to avoid chunks; this powdered mixture can be stored for many months prior to use. 2% agarose 0.5 g Agarose Add 25 ml dH2O. Heat in microwave until dissolved. 1M Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 2 g IPTG Dissolve in10 ml dH2O 1M NaN3 6.5 g NaN3 Add dH2O to 100 ml 25 mM NaN3 2.5 ml 1M NaN3 Add dH2O to 100 ml Caenorhabditis elegans from Caenorhabditis Genetics Center L4440 plasmid (carries ampicillin-resistance gene) Bacteria strain HT115 (DE3) (contains IPTG inducible T7 polymerase; deficient for RNAse III gene (a dsRNAse) which also carries tetracycline-resistance gene)16 60 mm Petri dishes 100 mm Petri dishes 14 ml round-bottom Falcon culture tubes glass slides glass coverslips 1-20 μl pipettor 20-200 μl pipettor 200-1000 μl pipettor 1-200 μl pipet tips 200-1000 μl pipet tips 1.5 ml Eppendorf tubes platinum wire worm pick |
References
- Melnyk, C. W., Molnar, A., Baulcombe, D. C. Intercellular and systemic movement of RNA silencing signals. Embo J. 30, 3553-3563 (2011).
- Wall, N. R., Shi, Y. Small RNA: can RNA interference be exploited for therapy. Lancet. 362, 1401-1403 (2003).
- Kalantidis, K., Schumacher, H. T., Alexiadis, T., Helm, J. M. RNA silencing movement in plants. Biol. Cell. 100, 13-26 (2008).
- Shim, M. S., Kwon, Y. J. Efficient and targeted delivery of siRNA in vivo. Febs. J. 277, 4814-4827 (2010).
- Amarzguioui, M., Rossi, J. J., Kim, D. Approaches for chemically synthesized siRNA and vector-mediated RNAi. FEBS Lett. 579, 5974-5981 (2005).
- Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30, 313-321 (2003).
- Savage-Dunn, C., et al. Genetic screen for small body size mutants in C. elegans reveals many TGFb pathway components. Genesis. 35, 239-247 (2003).
- Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854 (1998).
- Sulston, J. E., Horvitz, H. R. Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 56, 110-156 (1977).
- Wang, J., Tokarz, R., Savage-Dunn, C. The expression of TGFβ signal transducers in the hypodermis regulates body size in C. elegans. Development. 129, 4989-4998 (2002).
- Liang, J., et al. The Caenorhabditis elegans schnurri homolog sma-9 mediates stage- and cell type-specific responses to DBL-1 BMP-related signaling. Development. 130, 6453-6464 (2003).
- Savage-Dunn, C. TGF-β signaling. WormBook. , 1-12 (2005).
- Simmer, F., et al. Loss of the putative RNA-directed RNA polymerase RRF-3 makes C. elegans hypersensitive to RNAi. Curr. Biol. 12, 1317-1319 (2002).
- Wang, D., et al. Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants. Nature. 436, 593-597 (2005).
- De Robertis, E. M. Evo-devo: variations on ancestral themes. Cell. 132, 185-195 (2008).
- Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263, 103-112 (2001).
