Nematod Vücut büyüklüğü Yönetmelik ilgilendim Genler için Ekran RNA-aracılı Girişim Besleme Strateji Kullanımı<em> C. elegans</em
Summary
Biz hedef genler ve skoru vücut büyüklüğüne fenotipi yıkmak için RNAi besleme tekniği nasıl kullanılacağını göstermektedir<em> C. elegans</em>. Bu yöntem, bu tür DBL-1/TGF-β sinyalleme yoluyla vücut boyutu düzenlenmesinde yer alan bu gibi muhtemel ilgi genetik bileşenler, belirlemek için büyük ölçekli bir ekran için kullanılabilir.
Abstract
Çift iplikli RNA-aracılı girişim (RNAi) hedef gen ekspresyonu 1-3 yıkmak için etkili bir stratejidir. Bu bitkiler, omurgasızlar ve omurgalılar dahil birçok model sistemler uygulanmıştır. Vivo 4,5 RNAi ulaşmak için çeşitli yöntemler vardır. Örneğin, hedef gen, bir RNAi vektörü haline dönüştürülmesi ve daha sonra da sürekli veya geçici olarak hücre soyları ya da gen devirme etkileri elde etmek için birincil hücrelerine transforme edilebilir veya belirli bir hedef genin (RNAi Oligolar) için çift iplikli oligonükleotidler sentezlenebilir geçici olabilir hedef genleri susturmak için hücre hatları veya primer hücre dönüştürülmüştür; veya sentezlenen çift iplikli RNA molekülleri bir organizmanın içine mikroenjeksiyon yoluyla olabilir. Nematod C. yana elegans bakterileri hedef genlerin karşı çift iplikli RNA ifade ile hayvan besleme, bir gıda kaynağı olarak bakterileri kullanan uygun bir strateji 6. sağlar. Burada bir RNAi besleme sunmakyöntem vücut büyüklüğü fenotipi puan. C. Gövde boyutu elegans öncelikle TGF-β düzenlenir – gibi bir ligand DBL-1, böylece bu tahlil TGF-β sinyal bileşenleri 7 belirlenmesi için uygundur. Biz RNAi beslenme deneyleri tekrarlamak için iki RNAi duyarlı suşlar dahil farklı suşları kullanılmıştır. Bizim sonuçlarımız rrf-3 suşu bize en iyi beklenen RNAi fenotip verdiğini gösterdi. Yöntem, uygulanması kolay bir tekrarlanabilir ve kolayca ölçülür. Ayrıca, protokol özel ekipman kullanımını en aza indirir, bu nedenle daha küçük laboratuar ya da ağırlıklı olarak lisans kurumları da uygundur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, biz C. vücut büyüklüğü kusurlu mutantların belirlenmesi için yöntem tarif RNAi besleme ile elegans. Bu yöntem, TGF-β sinyal bileşenlerin tanımlanması için de geçerlidir. Gibi bileşenler yüksek evrim 15 yoluyla korunmuş olduğundan, bu ekranlar, tüm Metazoan'da TGF-β sinyal moleküler mekanizmalarının aydınlatılmasına alakalı. Böyle bir ekran tasarımında önemli bir göz başlayarak suşudur. Lin-15b ve rrf-3 önceki çalışmal…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz çeşitli gelişimsel zaman noktalarında hayvan figürleri sağlamak için James Clark ederim. C. Bu çalışmada elegans suşları Araştırma Kaynakları için NIH Ulusal Merkezi (NCRR) tarafından desteklenen Caenorhabditis Genetik Merkezi, elde edilmiştir. Bu çalışma CUNY gelen JL ve CSD CIRG 1817 tarafından desteklenen ve NIH 1R15GM073678-01 ve CSD 1R15GM097692-01 tarafından Biz yazması üzerine yorumlar için Dr William J Rice, Dr Nathalia Holtzman ve Melissa Silvestrini ederim. Bu çalışmaları, New York Şehir Üniversitesi (S. Xiong) ve Graduate Center'da bir doktora derecesi için gereksinimleri kısmen yerine getirilmesi yürütülmüştür.
Materials
| RNAi worm plates 17.7 g Worm Medium Mix 60 g Agar Add H2O to 3 liters. Autoclave. Add 3 ml 1M IPTG(sterile) and 3 ml 25 mg/ml Carbenicillin(sterile); then pour into 60 mm Petri dishes. Worm plates 17.7 g Worm Medium Mix 0.6 g Streptomycin Sulfate 60 g Agar Add H2O to 3 liters. Autoclave. Pour into 60 mm Petri dishes. Worm Medium Mix 55 g Tris-Cl 24 g Tris-OH 310 g Bacto Peptone 800 mg Cholesterol 200 g NaCl Mix thoroughly and be sure to avoid chunks; this powdered mixture can be stored for many months prior to use. 2% agarose 0.5 g Agarose Add 25 ml dH2O. Heat in microwave until dissolved. 1M Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 2 g IPTG Dissolve in10 ml dH2O 1M NaN3 6.5 g NaN3 Add dH2O to 100 ml 25 mM NaN3 2.5 ml 1M NaN3 Add dH2O to 100 ml Caenorhabditis elegans from Caenorhabditis Genetics Center L4440 plasmid (carries ampicillin-resistance gene) Bacteria strain HT115 (DE3) (contains IPTG inducible T7 polymerase; deficient for RNAse III gene (a dsRNAse) which also carries tetracycline-resistance gene)16 60 mm Petri dishes 100 mm Petri dishes 14 ml round-bottom Falcon culture tubes glass slides glass coverslips 1-20 μl pipettor 20-200 μl pipettor 200-1000 μl pipettor 1-200 μl pipet tips 200-1000 μl pipet tips 1.5 ml Eppendorf tubes platinum wire worm pick |
References
- Melnyk, C. W., Molnar, A., Baulcombe, D. C. Intercellular and systemic movement of RNA silencing signals. Embo J. 30, 3553-3563 (2011).
- Wall, N. R., Shi, Y. Small RNA: can RNA interference be exploited for therapy. Lancet. 362, 1401-1403 (2003).
- Kalantidis, K., Schumacher, H. T., Alexiadis, T., Helm, J. M. RNA silencing movement in plants. Biol. Cell. 100, 13-26 (2008).
- Shim, M. S., Kwon, Y. J. Efficient and targeted delivery of siRNA in vivo. Febs. J. 277, 4814-4827 (2010).
- Amarzguioui, M., Rossi, J. J., Kim, D. Approaches for chemically synthesized siRNA and vector-mediated RNAi. FEBS Lett. 579, 5974-5981 (2005).
- Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30, 313-321 (2003).
- Savage-Dunn, C., et al. Genetic screen for small body size mutants in C. elegans reveals many TGFb pathway components. Genesis. 35, 239-247 (2003).
- Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854 (1998).
- Sulston, J. E., Horvitz, H. R. Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 56, 110-156 (1977).
- Wang, J., Tokarz, R., Savage-Dunn, C. The expression of TGFβ signal transducers in the hypodermis regulates body size in C. elegans. Development. 129, 4989-4998 (2002).
- Liang, J., et al. The Caenorhabditis elegans schnurri homolog sma-9 mediates stage- and cell type-specific responses to DBL-1 BMP-related signaling. Development. 130, 6453-6464 (2003).
- Savage-Dunn, C. TGF-β signaling. WormBook. , 1-12 (2005).
- Simmer, F., et al. Loss of the putative RNA-directed RNA polymerase RRF-3 makes C. elegans hypersensitive to RNAi. Curr. Biol. 12, 1317-1319 (2002).
- Wang, D., et al. Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants. Nature. 436, 593-597 (2005).
- De Robertis, E. M. Evo-devo: variations on ancestral themes. Cell. 132, 185-195 (2008).
- Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263, 103-112 (2001).
