Met behulp van RNA-gemedieerde interferentie voerstrategie om te screenen op genen die betrokken zijn Lichaam Grootte verordening in de nematode<em> C. elegans</em
Summary
We laten zien hoe u de RNAi voeden techniek te gebruiken om knock down doelwitgenen en score lichaamsgrootte fenotype in<em> C. elegans</em>. Deze methode kan worden gebruikt voor een grote scherm potentiële genetische componenten van belang, zoals die welke in lichaamsgrootte regulering door DBL-1/TGF-β signalering identificeren.
Abstract
Dubbelstrengs RNA-gemedieerde interferentie (RNAi) is een effectieve strategie om knock down doelwit genexpressie 1-3. Het is toegepast op vele modelsystemen zoals planten, invertebraten en vertebraten. Er zijn verschillende methoden om RNAi bereiken in vivo 4,5. Bijvoorbeeld, het doelwitgen kan worden omgezet in een RNAi vector, en vervolgens permanent of tijdelijk omgezet in cellijnen of primaire cellen gen knockdown effecten te bereiken, als alternatief gesynthetiseerde dubbelstrengs oligonucleotiden van specifieke doelgenen (RNAi oligos) kan tijdelijk worden omgezet in cellijnen of primaire cellen doelgenen zwijgen, of gesynthetiseerde dubbelstrengs RNA moleculen worden gemicroinjecteerd in een organisme. Aangezien de nematode C. elegans gebruikt bacteriën als een bron van voedsel, het voeden van de dieren met bacteriën die dubbel-strengs RNA tegen target genen biedt een levensvatbare strategie 6. Hier presenteren we een RNAi voedenmethode om lichaamsgrootte fenotype scoren. Lichaamsgrootte in C. elegans wordt primair gereguleerd door de TGF-β – zoals ligand DBL-1, zodat deze test is geschikt voor identificatie van TGF-β signaleringscomponenten 7. We verschillende stammen gebruikt, waaronder twee RNAi overgevoelig stammen aan de RNAi voeden experimenten te herhalen. Onze resultaten laten zien dat RRF-3 stam gaf ons de beste verwachte RNAi fenotype. De methode is eenvoudig uit te voeren, reproduceerbare en gemakkelijk gekwantificeerd. Verder is onze protocol minimaliseert het gebruik van gespecialiseerde apparatuur, dus het is geschikt voor kleinere laboratoria of aan degenen met voornamelijk undergraduate instellingen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit protocol beschrijven we onze methode voor de identificatie van lichaamsgrootte defectieve mutanten van C. elegans door RNAi voeden. Deze methode is van toepassing op de identificatie van TGF-β uitschakeling. Aangezien dergelijke onderdelen worden geconserveerd door evolutie 15, zoals schermen relevant zijn voor het ophelderen van de moleculaire mechanismen van TGF-β signalering in alle metazoa. Een belangrijke overweging bij het ontwerpen van een dergelijk scherm is de uitgangsstam. We hebbe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken James Clark voor het verstrekken van gegevens van dieren bij verschillende ontwikkelingsstadia tijdstippen. C. elegans stammen in deze studie werden verkregen van het Caenorhabditis Genetics Center, die wordt ondersteund door de NIH National Center for Research Resources (NCRR). Dit werk werd ondersteund door CIRG 1817 van CUNY naar JL en CSD, en door NIH 1R15GM073678-01 en 1R15GM097692-01 tot CSD Wij danken dr. William J Rice, Dr Nathalia Holtzman, en Melissa Silvestrini voor commentaar op het manuscript. Dit werk werd uitgevoerd in gedeeltelijke vervulling van de vereisten voor een PhD-graad van de Graduate Center van de City University van New York (S. Xiong).
Materials
| RNAi worm plates 17.7 g Worm Medium Mix 60 g Agar Add H2O to 3 liters. Autoclave. Add 3 ml 1M IPTG(sterile) and 3 ml 25 mg/ml Carbenicillin(sterile); then pour into 60 mm Petri dishes. Worm plates 17.7 g Worm Medium Mix 0.6 g Streptomycin Sulfate 60 g Agar Add H2O to 3 liters. Autoclave. Pour into 60 mm Petri dishes. Worm Medium Mix 55 g Tris-Cl 24 g Tris-OH 310 g Bacto Peptone 800 mg Cholesterol 200 g NaCl Mix thoroughly and be sure to avoid chunks; this powdered mixture can be stored for many months prior to use. 2% agarose 0.5 g Agarose Add 25 ml dH2O. Heat in microwave until dissolved. 1M Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 2 g IPTG Dissolve in10 ml dH2O 1M NaN3 6.5 g NaN3 Add dH2O to 100 ml 25 mM NaN3 2.5 ml 1M NaN3 Add dH2O to 100 ml Caenorhabditis elegans from Caenorhabditis Genetics Center L4440 plasmid (carries ampicillin-resistance gene) Bacteria strain HT115 (DE3) (contains IPTG inducible T7 polymerase; deficient for RNAse III gene (a dsRNAse) which also carries tetracycline-resistance gene)16 60 mm Petri dishes 100 mm Petri dishes 14 ml round-bottom Falcon culture tubes glass slides glass coverslips 1-20 μl pipettor 20-200 μl pipettor 200-1000 μl pipettor 1-200 μl pipet tips 200-1000 μl pipet tips 1.5 ml Eppendorf tubes platinum wire worm pick |
References
- Melnyk, C. W., Molnar, A., Baulcombe, D. C. Intercellular and systemic movement of RNA silencing signals. Embo J. 30, 3553-3563 (2011).
- Wall, N. R., Shi, Y. Small RNA: can RNA interference be exploited for therapy. Lancet. 362, 1401-1403 (2003).
- Kalantidis, K., Schumacher, H. T., Alexiadis, T., Helm, J. M. RNA silencing movement in plants. Biol. Cell. 100, 13-26 (2008).
- Shim, M. S., Kwon, Y. J. Efficient and targeted delivery of siRNA in vivo. Febs. J. 277, 4814-4827 (2010).
- Amarzguioui, M., Rossi, J. J., Kim, D. Approaches for chemically synthesized siRNA and vector-mediated RNAi. FEBS Lett. 579, 5974-5981 (2005).
- Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30, 313-321 (2003).
- Savage-Dunn, C., et al. Genetic screen for small body size mutants in C. elegans reveals many TGFb pathway components. Genesis. 35, 239-247 (2003).
- Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854 (1998).
- Sulston, J. E., Horvitz, H. R. Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 56, 110-156 (1977).
- Wang, J., Tokarz, R., Savage-Dunn, C. The expression of TGFβ signal transducers in the hypodermis regulates body size in C. elegans. Development. 129, 4989-4998 (2002).
- Liang, J., et al. The Caenorhabditis elegans schnurri homolog sma-9 mediates stage- and cell type-specific responses to DBL-1 BMP-related signaling. Development. 130, 6453-6464 (2003).
- Savage-Dunn, C. TGF-β signaling. WormBook. , 1-12 (2005).
- Simmer, F., et al. Loss of the putative RNA-directed RNA polymerase RRF-3 makes C. elegans hypersensitive to RNAi. Curr. Biol. 12, 1317-1319 (2002).
- Wang, D., et al. Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants. Nature. 436, 593-597 (2005).
- De Robertis, E. M. Evo-devo: variations on ancestral themes. Cell. 132, 185-195 (2008).
- Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263, 103-112 (2001).
