Usando RNA mediada estratégia de alimentação Interferência em tela para genes envolvidos na regulação do tamanho corporal na Nemátodo<em> C. elegans</em

Summary

Nós demonstramos como usar a técnica de alimentação RNAi para derrubar genes-alvo e pontuação fenótipo tamanho do corpo<em> C. elegans</em>. Este método poderia ser utilizado para um ecrã de grande escala para identificar potenciais componentes genéticos de interesse, tais como aqueles que estão envolvidos na regulação do tamanho do corpo por sinalização DBL-1/TGF-β.

Abstract

Double-strand RNA de interferência mediada (RNAi) é uma estratégia eficaz para derrubar alvo de expressão gênica ^1-3. Ele foi aplicado a muitos sistemas de modelos, incluindo plantas, invertebrados e vertebrados. Existem vários métodos para atingir RNAi in vivo ^4,5. Por exemplo, o gene alvo pode ser transformado em um vetor de RNAi, e, em seguida, de forma permanente ou transitória transformado em linhas celulares ou células primárias para alcançar efeitos knockdown do gene, alternativamente sintetizados oligonucleótidos de cadeia dupla a partir de genes alvo específicos (RNAi oligos) pode ser transitoriamente transformadas em linhas celulares ou células primárias de silenciar genes alvo, ou sintetizados moléculas de ARN de cadeia dupla pode ser microinjectado num organismo. Uma vez que o nemátodo C. elegans usa bactérias como fonte de alimento, a alimentação dos animais com bactérias expressando RNA de cadeia dupla contra genes alvo proporciona uma estratégia viável ^6. Aqui apresentamos uma alimentação RNAimétodo para marcar fenótipo tamanho do corpo. Tamanho do corpo em C. elegans é regulado principalmente pelo TGF-β – ligante como DBL-1, de modo que este ensaio é adequado para a identificação de TGF-β componentes de sinalização ^7. Usamos diferentes cepas incluindo duas linhagens de RNAi hipersensíveis repetir os experimentos de alimentação de RNAi. Nossos resultados mostraram que RRF-3 tensão nos deu o melhor fenótipo RNAi esperado. O método é de fácil execução, reprodutível e facilmente quantificada. Além disso, o nosso protocolo minimiza o uso de equipamento especializado, pelo que é adequado para laboratórios menores ou aqueles em instituições predominantemente de graduação.

Protocol

1. Preparando Placas de alimentação RNAi de transporte sequência do gene alvo Se o uso de bibliotecas disponíveis comercialmente RNAi (por exemplo, de LifeSciences Fonte BioScience), vá para o passo 1.4. Alternativamente, clonar seqüências de genes-alvo em vetor L4440, um worm comumente usado RNAi plasmídeo 8, por meio de protocolo de clonagem padrão. Transformar o plasmídeo recombinante na estirpe bacteriana HT115 (DE3), a cultura deles em placas de agar LB com 25 ug /…

Representative Results

Em nossa pesquisa, focamos na regulação do tamanho corporal pela via DBL-1/TGF-β. A perda da função dos resultados DBL-1 via de tamanho pequeno corpo, incluindo um menor comprimento de corpo comparado com animais de tipo selvagem 7,10,11. Assim, telas para C. mutantes tamanho elegans do corpo são capazes de identificar os componentes de sinalização de TGF-β e modificadores. DBL-1 sinalização é mediada por uma via de transdução conservada TGF-β sinal que inclui os receptores da…

Discussion

Neste protocolo, descrevemos o nosso método para a identificação de mutantes defeituosos o tamanho do corpo de C. elegans alimentação por RNAi. Este método é aplicável para a identificação dos componentes de sinalização de TGF-β. Uma vez que estes componentes são altamente conservadas através da evolução ^15, tais telas são relevantes para elucidar os mecanismos moleculares de TGF-β sinalização em todos metazoários. Uma consideração importante na concepção de uma tal tela é …

Materials

RNAi worm plates 17.7 g Worm Medium Mix 60 g Agar Add H2O to 3 liters. Autoclave. Add 3 ml 1M IPTG(sterile) and 3 ml 25 mg/ml Carbenicillin(sterile); then pour into 60 mm Petri dishes. Worm plates 17.7 g Worm Medium Mix 0.6 g Streptomycin Sulfate 60 g Agar Add H2O to 3 liters. Autoclave. Pour into 60 mm Petri dishes. Worm Medium Mix 55 g Tris-Cl 24 g Tris-OH 310 g Bacto Peptone 800 mg Cholesterol 200 g NaCl Mix thoroughly and be sure to avoid chunks; this powdered mixture can be stored for many months prior to use. 2% agarose 0.5 g Agarose Add 25 ml dH2O. Heat in microwave until dissolved. 1M Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 2 g IPTG Dissolve in10 ml dH2O 1M NaN3 6.5 g NaN3 Add dH2O to 100 ml 25 mM NaN3 2.5 ml 1M NaN3 Add dH2O to 100 ml Caenorhabditis elegans from Caenorhabditis Genetics Center L4440 plasmid (carries ampicillin-resistance gene) Bacteria strain HT115 (DE3) (contains IPTG inducible T7 polymerase; deficient for RNAse III gene (a dsRNAse) which also carries tetracycline-resistance gene)16 60 mm Petri dishes 100 mm Petri dishes 14 ml round-bottom Falcon culture tubes glass slides glass coverslips 1-20 μl pipettor 20-200 μl pipettor 200-1000 μl pipettor 1-200 μl pipet tips 200-1000 μl pipet tips 1.5 ml Eppendorf tubes platinum wire worm pick