Bruke RNA-mediert interferens fôringsstrategi til skjerm for gener involvert i Body Size forordning i nematode<em> C. elegans</em

Summary

Vi viser hvordan du bruker RNAi fôring teknikk for å slå ned målgener og score kroppsstørrelse fenotype i<em> C. elegans</em>. Denne metoden kan brukes for et stort skala skjermen for å identifisere potensielle genetiske komponenter av interesse, slik som de som er involvert i kroppsstørrelse regulering gjennom DBL-1/TGF-β signalering.

Abstract

Double-strand RNA-mediert interferens (RNAi) er en effektiv strategi for å slå ned målet genuttrykk ^1-3. Det har blitt brukt til mange modell systemer, inkludert planter, dyr og virveldyr. Det finnes ulike metoder for å oppnå RNAi in vivo ^4,5. For eksempel kan målgenet bli transformert til en RNAi vektor, og deretter enten permanent eller forbigående forvandlet til cellelinjer eller primære celler for å oppnå genet knockdown effekter, alternativt syntetisert dobbelt-strand oligonukleotider fra bestemte målgener (RNAi oligoer) kan være forbigående forvandlet til cellelinjer og primære celler for å slå målgener, eller syntetisert dobbel tråd RNA-molekyler kan microinjected i en organisme. Siden nematode C. elegans bruker bakterier som matkilde, mate dyr med bakterier uttrykker dobbel tråd RNA mot målgener gir en levedyktig strategi ^6. Her presenterer vi en RNAi fôringmetode å score kroppsstørrelse fenotype. Kroppsstørrelse i C. elegans reguleres primært ved TGF-β – som ligand DBL-1, slik at denne analysen er hensiktsmessig for identifisering av TGF-β signalnettverk komponenter ^7. Vi brukte forskjellige stammer inkludert to RNAi hypersensitive stammer å gjenta RNAi fôring eksperimenter. Våre resultater viste at RRF-3 belastning ga oss den beste forventede RNAi fenotype. Metoden er enkel å utføre, reproduserbar, og lett kvantifisert. Videre reduserer vår protokoll bruk av spesialisert utstyr, så det er egnet for mindre laboratorier eller de på hovedsakelig lavere institusjoner.

Protocol

1. Forbereder RNAi Feeding Plater Bære Target Gene Sequence Hvis du bruker kommersielt tilgjengelige RNAi bibliotekene (f.eks fra Source BioScience LifeSciences), går du til trinn 1.4. Alternativt klone target gensekvenser i L4440 vektor, en vanlig orm RNAi plasmid 8, etter standard kloning protokoll. Transformere rekombinant plasmid inn bakteriestammen HT115 (DE3), kultur dem på LB agarplater med 25 ug / ml Carbenicillin og 12,5 ug / ml tetracyklin, og velge en enkelt klon fo…

Representative Results

I vår forskning har vi fokus på kroppsstørrelse regulering av DBL-1/TGF-β veien. Tap av funksjon av DBL-1 bane resulterer i liten kroppsstørrelse, inkludert en kortere kroppslengde sammenlignet med vill-type dyr 7,10,11. Dermed skjermer for C. elegans kroppsstørrelse mutanter er i stand til å identifisere TGF-β signalering komponenter og modifikatorer. DBL-1 signalering er mediert av et konservert TGF-β signaltransduksjon sti som inkluderer celleoverflatereseptorer og intracellulære Smad si…

Discussion

I denne protokollen, beskriver vi vår metode for identifisering av kroppsstørrelse defekte mutanter av C. elegans av RNAi fôring. Denne metoden kan anvendes til identifisering av TGF-β signalveier komponenter. Siden slike komponenter er svært konservert gjennom evolusjonen ^15, slike skjermer er relevante for å belyse de molekylære mekanismene for TGF-β signalering i alle metazoans. Et viktig hensyn i utformingen slik skjerm er utgangspunktet belastningen. Vi har vist at både Eri-1, lin-1…

Materials

RNAi worm plates 17.7 g Worm Medium Mix 60 g Agar Add H2O to 3 liters. Autoclave. Add 3 ml 1M IPTG(sterile) and 3 ml 25 mg/ml Carbenicillin(sterile); then pour into 60 mm Petri dishes. Worm plates 17.7 g Worm Medium Mix 0.6 g Streptomycin Sulfate 60 g Agar Add H2O to 3 liters. Autoclave. Pour into 60 mm Petri dishes. Worm Medium Mix 55 g Tris-Cl 24 g Tris-OH 310 g Bacto Peptone 800 mg Cholesterol 200 g NaCl Mix thoroughly and be sure to avoid chunks; this powdered mixture can be stored for many months prior to use. 2% agarose 0.5 g Agarose Add 25 ml dH2O. Heat in microwave until dissolved. 1M Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 2 g IPTG Dissolve in10 ml dH2O 1M NaN3 6.5 g NaN3 Add dH2O to 100 ml 25 mM NaN3 2.5 ml 1M NaN3 Add dH2O to 100 ml Caenorhabditis elegans from Caenorhabditis Genetics Center L4440 plasmid (carries ampicillin-resistance gene) Bacteria strain HT115 (DE3) (contains IPTG inducible T7 polymerase; deficient for RNAse III gene (a dsRNAse) which also carries tetracycline-resistance gene)16 60 mm Petri dishes 100 mm Petri dishes 14 ml round-bottom Falcon culture tubes glass slides glass coverslips 1-20 μl pipettor 20-200 μl pipettor 200-1000 μl pipettor 1-200 μl pipet tips 200-1000 μl pipet tips 1.5 ml Eppendorf tubes platinum wire worm pick