I artikeln detaljerna protokollet för platsspecifik transfektion av oordning sekvens av siRNA i en vidhäftande däggdjurscellkultur med en mikroelektrod array (MEA).
Upptäckten av RNAi väg i eukaryoter och den efterföljande utvecklingen av RNAi medel, såsom siRNA och shRNA, har uppnått en potent metod för att tysta specifika gener 1-8 för funktionsgenomik och terapier. En stor utmaning som deltar i RNAi-baserade studier är leverans av RNAi medel till riktade celler. Traditionella icke-virala leverans tekniker, såsom bulk elektroporering och kemiska metoder för transfektion saknar ofta den nödvändiga rumsliga kontrollen över leverans och ge dålig transfektionseffektiviteter 9-12. Nyligen gjorda framsteg i kemiska transfektionsmetoder såsom katjoniska lipider, katjoniska polymerer och nanopartiklar har resulterat i mycket förbättrade transfektionseffektiviteten 13. Men dessa tekniker fortfarande inte erbjuda exakt rumslig kontroll över leveransen som oerhört kan dra miniatyriserade teknik med hög kapacitet, ensamstående studier cell och utredning av cell-cell interaktioner.
nt "> Nya tekniska framsteg inom gen leverans har möjliggjort hög genomströmning transfektion av vidhäftande celler 14-23, varav en majoritet använder mikroskala elektroporering. Microscale elektroporering ger exakt plats och tid kontroll över leverans (upp till enstaka celler) och har visats uppnå höga verkningsgrader 19, 24-26. Dessutom kräver elektroporation angreppssätt inte en förlängd inkubationsperiod (typiskt 4 timmar) med siRNA och DNA-komplex som behövs kemiska baserade transfektionsmetoder och leda till direkt inmatning av naket siRNA och DNA molekyler i cellens cytoplasma. Som en följd genuttryck kan uppnås så tidigt som sex timmar efter transfektion 27. Vårt laboratorium har tidigare visat att användningen av mikroelektrod arrayer (MEA) för platsspecifik transfektion i adherenta däggdjurscellkulturer 17-19. I MEA synsätt, är leverans av genetisk nyttolast uppnås genom lokal mikroskala electroporatipå celler. En tillämpning av elektrisk puls till utvalda elektroder genererar lokala elektriska fält som leder till elektroporering av celler närvarande i området för de stimulerade elektroderna. Den oberoende kontroll av mikro-elektroderna ger rumsliga och tidsmässiga kontroll över transfektion och möjliggör även flera transfektion baserade experiment som skall utföras på samma kultur ökar experimentella genomströmningen och minska kulturen till kultur variabilitet.Här beskriver vi den experimentella inställning och protokollet för riktade transfektion av vidhäftande HeLa-celler med en fluorescerande märkt kodad sekvens siRNA med elektroporering. Samma protokoll kan också användas för transfektion av plasmidvektorer. Dessutom, kan det protokoll som beskrivits här kan lätt utsträckas till ett flertal däggdjurscellinjer med mindre modifieringar. Kommersiella tillgängligheten av MEA med både fördefinierade och anpassade elektrodmönster gör denna teknik tillgänglig to de flesta forskningslaboratorier med grundläggande cellkultur utrustning.
I denna video artikeln visar vi att använda MEA för platsspecifik transfektion av HeLa-celler med oordning sekvens av siRNA. En av fördelarna med denna teknik är dess tillämpbarhet på olika cellinjer inklusive primära cellinjer. Vårt laboratorium har tidigare visat användningen av denna teknik för platsspecifik transfektion av primär hippocampus neuronal kultur från E18 dagar gammal råtta och NIH-3T3-celler med kodade siRNA sekvenser och GFP plasmid 18, 19. Vi har också haft framgång i att leve…
The authors have nothing to disclose.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Cell media: Advanced MEM L-Glutamine 200 mM Penicillin/Streptomycin Fetal bovine serum |
Gibco/Invitrogen Himedia Laboratories/VWR Lonza group Ltd. Gibco/Invitrogen |
12492-013 95057-448 09-757F 16000-044 |
Cell media composition: 2% FBS, 2%L-glutamine and 2% Pennstrep in Advance MEM |
Trypsin EDTA | Mediatech, Inc. | 25-053-CL | |
PBS | Mediatech, Inc. | 21-040-CV | |
Alexa 488 and rhodamine tagged scrambled sequence siRNA | Qiagen, Inc. | 1027292 | |
Electroporation buffer | Biorad Laboratories | 165-2677 | |
Waveform generator | Pragmatic | 2414A | Any waveform/pulse generator that can deliver the desired pulses can be used. |