Microelectrode 배열을 사용하여 siRNA와 자기편 세포의 높은 효율, 특정 사이트 Transfection (MEA)
Summary
microelectrode 배열 (MEA)를 사용하여 자기편 포유류의 세포 배양에 siRNA의 스크램블 시퀀스의 특정 사이트 transfection에 대한 기사 내용은 프로토콜.
Abstract
eukaryotes 및 siRNA와 shRNA 등의 RNAi 요원의 후속 개발에 RNAi 경로의 발견, 기능 유전체학 및 치료학에 대한 특정 유전자에게 1-8 입을위한 강력한 방법을 달성했습니다. RNAi 기반 연구에 참여하고있는 주요 과제는 대상 셀에 대한 RNAi 요원의 전달입니다. 이러한 대량 electroporation 및 화학 transfection 방법 등의 전통 비 바이러스 성 전달 기술은 종종 배달을 통해 필요한 공간 컨트롤을 결여하고 9-12 가난한 transfection 효율 여유. 이러한 양이온 지질, 양이온 폴리머와 나노 입자 등의 화학 transfection 방법의 최근 발전은 매우 향상된 transfection 효율 13 결과했습니다. 그러나 이러한 기술은 아직 상당히 높은 처리량 기술, 단일 세포 연구 및 세포 세포의 상호 작용 조사를 소형화 혜택을 누릴 수 있습니다 전달 이상 정확한 공간 제어를 제공하기 위해 실패합니다.
NT는 "유전자 전달에> 최근 기술 진보. 자기편 세포의 높은 처리량 transfection 14-23, microscale electroporation을 사용하는 대부분을 사용하도록 설정 한 Microscale electroporation은 (최대 단일 셀에) 전달 이상 정확한 spatio – 시간적 제어를 제공하며, 표시되었습니다 또한 높은 효율성 19 24-26을. 달성하기 위해, electroporation 기반의 접근 방식은 화학 기반의 transfection 방법에 필요한 siRNA와 DNA 단지와 부화의 연장 기간을 (일반적으로 4 시간)이 필요하고 벌거 벗은 siRNA와 DNA의 직접 항목으로 이어지지 않는 세포 세포질에 분자. 결과 유전자 발현으로는 transfection 27 후 육시간 초부터 달성 될 수있다. 우리 연구소는 이전에 다음 ID로 자기편 포유류의 세포 배양 17-19에서 특정 사이트 transfection에 대한 microelectrode 배열의 사용 (MEA)를 보여주었습니다. MEA 기반의 접근 방식에서, 유전자 페이로드의 전송이 지역화 된 마이크로 스케일 electroporati를 통해 이루어집니다세포의 있습니다. 선택한 전극에 전기 펄스의 응용 프로그램은 자극 전극의 지역에 존재하는 세포의 electroporation로 연결 지역 전기장을 생성합니다. 마이크로 전극의 독립적 인 제어 transfection 이상의 공간과 측두엽 제어 기능을 제공하고 또한 실험 처리량을 증가와 문화 – 투 – 문화 다양성을 감소 같은 문화에 수행 할 여러 transfection 기반의 실험을 할 수 있습니다.여기 우리는 실험 설정 및 electroporation을 사용하여 휘황 태그 불가능한 시퀀스 siRNA와 자기편 헬러 전지의 대상 transfection에 대한 프로토콜을 설명합니다. 동일한 프로토콜은 또한 플라스미드 벡터의 transfection에 사용하실 수 있습니다. 또한 여기에 기술 된 프로토콜은 쉽게 약간의 수정을 포유류의 세포 라인의 다양한 확장 할 수 있습니다. 사전 정의 및 사용자 정의 모두 전극 패턴과 MEAs의 상용 여부는이 기술 접근 할 수 t를기본 세포 배양 장비와 O 대부분의 연구 실험실.
Protocol
1. MEA 준비 이전 18 설명 또는 멀티 채널 시스템과 같은 MEA 제조 업체의 공급 업체에서 직접 구입으로 electroporation 실험에 사용 MEAs는 두 표준 석판 술 기술을 사용하여 제조 될 수있다 (http:/www.multichannelsystems.com/) 및 알파 MED 과학 주식회사 ( http://www.MED64.com)가 . 우리 실험에 사용 된 MEAs는 고체 ?…
Discussion
이 동영상 글에서 우리는 siRNA의 스크램블 순서와 헬러 세포의 특정 사이트 transfection을위한 MEA의 사용을 보여줍니다. 이 기술의 장점 중 하나는 기본 세포 라인을 포함한 여러 세포 라인에의 적용이다. 우리 연구실은 이전에 E18 일 늙은 쥐와 스크램블 siRNA 시퀀스와 플라스미드 GFP 18, 19와 NIH-3T3 세포에서 기본 hippocampal neuronal 문화의 특정 사이트 transfection이 기술의 사용을 보여주었습니다….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Cell media: Advanced MEM L-Glutamine 200 mM Penicillin/Streptomycin Fetal bovine serum |
Gibco/Invitrogen Himedia Laboratories/VWR Lonza group Ltd. Gibco/Invitrogen |
12492-013 95057-448 09-757F 16000-044 |
Cell media composition: 2% FBS, 2%L-glutamine and 2% Pennstrep in Advance MEM |
| Trypsin EDTA | Mediatech, Inc. | 25-053-CL | |
| PBS | Mediatech, Inc. | 21-040-CV | |
| Alexa 488 and rhodamine tagged scrambled sequence siRNA | Qiagen, Inc. | 1027292 | |
| Electroporation buffer | Biorad Laboratories | 165-2677 | |
| Waveform generator | Pragmatic | 2414A | Any waveform/pulse generator that can deliver the desired pulses can be used. |
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Cite This Article
Patel, C., Muthuswamy, J. High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA). J. Vis. Exp. (67), e4415, doi:10.3791/4415 (2012).