Hög effektivitet, Platsspecifik transfektion av vidhäftande celler med siRNA Använda mikroelektrod Arrays (MEA)
Summary
I artikeln detaljerna protokollet för platsspecifik transfektion av oordning sekvens av siRNA i en vidhäftande däggdjurscellkultur med en mikroelektrod array (MEA).
Abstract
Upptäckten av RNAi väg i eukaryoter och den efterföljande utvecklingen av RNAi medel, såsom siRNA och shRNA, har uppnått en potent metod för att tysta specifika gener 1-8 för funktionsgenomik och terapier. En stor utmaning som deltar i RNAi-baserade studier är leverans av RNAi medel till riktade celler. Traditionella icke-virala leverans tekniker, såsom bulk elektroporering och kemiska metoder för transfektion saknar ofta den nödvändiga rumsliga kontrollen över leverans och ge dålig transfektionseffektiviteter 9-12. Nyligen gjorda framsteg i kemiska transfektionsmetoder såsom katjoniska lipider, katjoniska polymerer och nanopartiklar har resulterat i mycket förbättrade transfektionseffektiviteten 13. Men dessa tekniker fortfarande inte erbjuda exakt rumslig kontroll över leveransen som oerhört kan dra miniatyriserade teknik med hög kapacitet, ensamstående studier cell och utredning av cell-cell interaktioner.
nt "> Nya tekniska framsteg inom gen leverans har möjliggjort hög genomströmning transfektion av vidhäftande celler 14-23, varav en majoritet använder mikroskala elektroporering. Microscale elektroporering ger exakt plats och tid kontroll över leverans (upp till enstaka celler) och har visats uppnå höga verkningsgrader 19, 24-26. Dessutom kräver elektroporation angreppssätt inte en förlängd inkubationsperiod (typiskt 4 timmar) med siRNA och DNA-komplex som behövs kemiska baserade transfektionsmetoder och leda till direkt inmatning av naket siRNA och DNA molekyler i cellens cytoplasma. Som en följd genuttryck kan uppnås så tidigt som sex timmar efter transfektion 27. Vårt laboratorium har tidigare visat att användningen av mikroelektrod arrayer (MEA) för platsspecifik transfektion i adherenta däggdjurscellkulturer 17-19. I MEA synsätt, är leverans av genetisk nyttolast uppnås genom lokal mikroskala electroporatipå celler. En tillämpning av elektrisk puls till utvalda elektroder genererar lokala elektriska fält som leder till elektroporering av celler närvarande i området för de stimulerade elektroderna. Den oberoende kontroll av mikro-elektroderna ger rumsliga och tidsmässiga kontroll över transfektion och möjliggör även flera transfektion baserade experiment som skall utföras på samma kultur ökar experimentella genomströmningen och minska kulturen till kultur variabilitet.Här beskriver vi den experimentella inställning och protokollet för riktade transfektion av vidhäftande HeLa-celler med en fluorescerande märkt kodad sekvens siRNA med elektroporering. Samma protokoll kan också användas för transfektion av plasmidvektorer. Dessutom, kan det protokoll som beskrivits här kan lätt utsträckas till ett flertal däggdjurscellinjer med mindre modifieringar. Kommersiella tillgängligheten av MEA med både fördefinierade och anpassade elektrodmönster gör denna teknik tillgänglig to de flesta forskningslaboratorier med grundläggande cellkultur utrustning.
Protocol
Discussion
I denna video artikeln visar vi att använda MEA för platsspecifik transfektion av HeLa-celler med oordning sekvens av siRNA. En av fördelarna med denna teknik är dess tillämpbarhet på olika cellinjer inklusive primära cellinjer. Vårt laboratorium har tidigare visat användningen av denna teknik för platsspecifik transfektion av primär hippocampus neuronal kultur från E18 dagar gammal råtta och NIH-3T3-celler med kodade siRNA sekvenser och GFP plasmid 18, 19. Vi har också haft framgång i att leve…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Cell media: Advanced MEM L-Glutamine 200 mM Penicillin/Streptomycin Fetal bovine serum |
Gibco/Invitrogen Himedia Laboratories/VWR Lonza group Ltd. Gibco/Invitrogen |
12492-013 95057-448 09-757F 16000-044 |
Cell media composition: 2% FBS, 2%L-glutamine and 2% Pennstrep in Advance MEM |
| Trypsin EDTA | Mediatech, Inc. | 25-053-CL | |
| PBS | Mediatech, Inc. | 21-040-CV | |
| Alexa 488 and rhodamine tagged scrambled sequence siRNA | Qiagen, Inc. | 1027292 | |
| Electroporation buffer | Biorad Laboratories | 165-2677 | |
| Waveform generator | Pragmatic | 2414A | Any waveform/pulse generator that can deliver the desired pulses can be used. |
References
- Fire, A. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Caplen, N. J., Parrish, S., Imani, F., Fire, A., Morgan, R. A. Specific inhibition of gene expression by small double-stranded RNAs in invertebrate and vertebrate systems. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98, 9742 (2001).
- Elbashir, S. M. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 411, 494-498 (2001).
- Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science. 296, 550 (2002).
- Lee, N. S. Expression of small interfering RNAs targeted against HIV-1 rev transcripts in human cells. Nat. Biotechnol. 20, 500-505 (2002).
- Miyagishi, M., Taira, K. U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3′ overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells. Nat. Biotechnol. 20, 497-500 (2002).
- Paul, C. P., Good, P. D., Winer, I., Engelke, D. R. Effective expression of small interfering RNA in human cells. Nat. Biotechnol. 20, 505-508 (2002).
- Xia, H., Mao, Q., Paulson, H. L., Davidson, B. L. siRNA-mediated gene silencing in vitro and in vivo. Nat. Biotechnol. 20, 1006-1010 (2002).
- Chu, G., Hayakawa, H., Berg, P. Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA. Nucleic Acids Res. 15, 1311 (1987).
- Felgner, P. L. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy of Sciences. 84, 7413 (1987).
- Raptis, L. H. applications of electroporation of adherent cells in situ, on a partly conductive slide. Mol. Biotechnol. 4, 129-138 (1995).
- Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. Transfecting mammalian cells: optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation. Nucleic Acids Res. 24, 596-601 (1996).
- Gao, Y., Liu, X. L., Li, X. R. Research progress on siRNA delivery with nonviral carriers. International Journal of Nanomedicine. 6, 1017 (2011).
- Ziauddin, J., Sabatini, D. M. Microarrays of cells expressing defined cDNAs. Nature. 411, 107-110 (2001).
- Yamauchi, F., Kato, K., Iwata, H. Spatially and temporally controlled gene transfer by electroporation into adherent cells on plasmid DNA-loaded electrodes. Nucleic Acids Res. 32, e187 (2004).
- Yamauchi, F., Kato, K., Iwata, H. Layer-by-Layer Assembly of Poly (ethyleneimine) and Plasmid DNA onto Transparent Indium? Tin Oxide Electrodes for Temporally and Spatially Specific Gene Transfer. Langmuir. 21, 8360-8367 (2005).
- Jain, T., Muthuswamy, J. Microsystem for transfection of exogenous molecules with spatio-temporal control into adherent cells. Biosensors and Bioelectronics. 22, 863-870 (2007).
- Jain, T., Muthuswamy, J. Bio-chip for spatially controlled transfection of nucleic acid payloads into cells in a culture. Lab on a Chip. 7, 1004-1011 (2007).
- Jain, T., Muthuswamy, J. Microelectrode array (MEA) platform for targeted neuronal transfection and recording. Biomedical Engineering, IEEE Transactions on. 55, 827-832 (2008).
- Jain, T., McBride, R., Head, S., Saez, E. Highly parallel introduction of nucleic acids into mammalian cells grown in microwell arrays. Lab on a Chip. 9, 3557-3566 (2009).
- Huang, H. An efficient and high-throughput electroporation microchip applicable for siRNA delivery. Lab Chip. 11, 163-172 (2010).
- Li, Z., Wei, Z., Li, X., Du, Q., Liang, Z. Efficient and high-throughput electroporation chips. , (2011).
- Jain, T., Papas, A., Jadhav, A., McBride, R., Saez, E. In situ electroporation of surface-bound siRNAs in microwell arrays. Lab Chip. 12, 939-947 (2012).
- Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-Cell Electroporationfor Gene Transfer In Vivo. Neuron. 29, 583-591 (2001).
- Akaneya, Y., Jiang, B., Tsumoto, T. RNAi-induced gene silencing by local electroporation in targeting brain region. J. Neurophysiol. 93, 594 (2005).
- Lee, W. G., Demirci, U., Khademhosseini, A. Microscale electroporation: challenges and perspectives for clinical applications. Integr. Biol. 1, 242-251 (2009).
- Boukany, P. E. Nanochannel electroporation delivers precise amounts of biomolecules into living cells. Nature Nanotechnology. 6, 747-754 (2011).
