Summary

Trans-vivo de type hypersensibilité retardée test pour le règlement spécifique de l'antigène

Published: May 02, 2013
doi:

Summary

Nous décrivons un test de diagnostic précieux qui pourrait être utilisé pour décider du retrait de l'immunosuppression après transplantation sans risque élevé de rejet du greffon. Le test utilise les principes de type hypersensibilité retardée et fournit une évaluation précise de ces deux réponses immunitaires effectrices et réglementaires spécifiques donneur supporté par les bénéficiaires.

Abstract

Réponse d'hypersensibilité de type retardé (DTH) est une rapide manifestation vivo de la réponse immunitaire des cellules T dépendantes à un antigène étranger (Ag) que le système immunitaire de l'hôte a connu dans un passé récent. Réactions SRD sont souvent divisés en une phase de sensibilisation, se référant à l'expérience initiale de l'antigène, et une phase de défi, qui suit généralement plusieurs jours après la sensibilisation. L'absence d'une réaction d'hypersensibilité de type retardé à un Ag rappel démontré par des tests cutanés est souvent considéré comme une preuve d'anergie. Le test de SRD traditionnel a été effectivement utilisé dans le diagnostic de nombreuses infections microbiennes.

Bien qu'ils partagent des caractéristiques immunitaires similaires tels que l'infiltration lymphocytaire, l'œdème et une nécrose des tissus, le DTH directe n'est pas une technique de diagnostic possible chez les patients transplantés en raison de la possibilité d'une injection directe entraîne une sensibilisation à des antigènes du donneur et la perte du greffon. Pour éviter ce problème, le bourdonnementun-à-souris de test DTH "trans-vivo" a été développé 1,2. Ce test est essentiellement un test de DTH de transfert, dans lequel les cellules humaines mononucléées du sang périphérique (CMSP) et les antigènes spécifiques ont été injectés par voie sous cutanée dans le coussinet plantaire pennes ou d'une souris naïve et gonflement DTH-like est mesurée après 18-24 h 3. La présentation de l'antigène par les cellules présentatrices d'antigènes humains telles que les macrophages ou DCS pour les cellules T dans un tissu très vasculaire de la souris déclenche la cascade inflammatoire et attire les cellules du système immunitaire de la souris dans les réponses résultant de gonflement. La réaction est spécifique de l'antigène et nécessite une sensibilisation préalable de l'antigène. Une réponse DTH donateurs réactive positive dans le dosage Tv-SRD reflète le fait que le patient transplanté a développé une disposition pro-inflammatoire immunitaire vers alloantigènes greffe.

La caractéristique la plus importante de ce test est qu'il peut également être utilisé pour détecter les cellules T régulatrices, qui provoquent la suppression du spectateur. suppression du spectateur d'unRéponse de rappel DTH en présence de l'antigène de donneur est caractéristique des greffés avec des allogreffes acceptées 2,4-14. Le suivi des patients transplantés pour alloréactivité et la régulation par la télévision DTH peut identifier un sous-ensemble de patients qui pourraient bénéficier de la réduction de l'immunosuppression sans risque élevé de rejet ou de détérioration de la fonction rénale.

Un domaine prometteur est l'application du test Tv-DTH dans le suivi de l'auto-immunité 15,16 et également en immunologie tumorale 17.

Protocol

1. Préparation des lymphocytes Recueillir le sang dans des tubes ACD (acide citrate dextrose). Isoler PBMC du sang périphérique humain frais en utilisant des lymphocytes milieu de séparation selon les méthodes classiques. Laver les CMSP trois fois avec PBS pour éliminer les plaquettes contaminantes. Les plaquettes ont été trouvés pour interférer avec dosage de SRD trans-vivo. Maximal admissible de contamination plaquettaire préparation des CMSP est ≤ 1×10 7 / inject…

Representative Results

1. Évaluation des receveurs de transplantation rénale pour une réponse spécifique de l'antigène donneur en utilisant un dosage Tv-DTH Pour tester le donneur réactif immunité cellulaire chez les transplantés rénaux nous avons injecté PBMC de ces patients avec des antigènes du donneur seul ou avec un rappel antigène anatoxine tétanique (TT). En tant que cellules de contrôle positif ont été injectés avec TT seul. Nous observons trois grandes tendances de l'hypersensibilit?…

Discussion

Le test DTH trans-vivo est un test diagnostique roman avec une application clinique potentielle dans l'évaluation des réponses à médiation cellulaire en transplantation, le cancer et les patients auto-immunes. Il est précieux car il n'est pas seulement utile dans le suivi rappel réponses effectrices T, mais il peut aussi détecter des réponses T régulatrices. Un moyen fiable de détecter la réglementation DTH humain peut prédire la sécurité du retrait de l'immunosuppression chez les patients qui …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs tiennent à souligner la contribution de AM VanBuskirk au développement de notre compréhension de la réponse DTH réglementé chez les greffés. Ce travail a été soutenu subventions des NIH PO1AI084853 et R01AI066219-06, et par l'UE parrainé une étude.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
ACD tube for blood collection BD 02-684-26  
Lymphocyte Separation Medium Cellgro 25-072-CV  
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline Cellgro 21-031-CM Without calcium & magnesium
ACK Lysis Buffer BioWhittaker 10-548E  
TT/DT or EBV Sanofi Pasteur Inc./ Meridian Life Science, Inc.   TT/DT 25 μg/injection EBV 8 μg/injection
Protease inhibitor PMSF Sigma-Aldrich 78830  
Eosine for cell count Sigma-Aldrich E-6003  
Alloantigen     Purified HLA antigens, synthetic allopeptides can be used instead of donor cell-free lysates
50 ml sterile centrifuge tubes Fisher Scientific 06-443-18  
10 ml pipettes and pipettor BD Falcon 13-675-20  
2 ml safe-lock tubes Costar 3213  
1000 μl, 100 μl , 10 μl pipettes with sterile tips      
Hemocytometer Fisher 02-671-10  
Full size centrifuge and microfuge Beckman Coulter/Eppendorf    
1/2cc or 1cc insulin syringes Becton Dickinson 14-826-79 28 gauge
Vibracell sonicator Divtech Equipment Co. Sonocs& Materials Inc   2 mm probe
Dial thickness gauge Mitutoyo, Japan    
SCID mice Harlan    
Isoflurane Piramal Healthcare   Inhalant anesthesia

References

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Cite This Article
Jankowska-Gan, E., Hegde, S., Burlingham, W. J. Trans-vivo Delayed Type Hypersensitivity Assay for Antigen Specific Regulation. J. Vis. Exp. (75), e4454, doi:10.3791/4454 (2013).

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