Summary
Se describe un ensayo de diagnóstico valiosa que potencialmente podría ser utilizado para decidir la retirada de la inmunosupresión después del trasplante sin riesgo elevado de rechazo del injerto. El ensayo utiliza los principios de la hipersensibilidad de tipo retardado y proporciona una evaluación precisa de ambos donantes respuestas inmunes efectoras y reglamentarias específicas montados por los destinatarios.
Abstract
Respuesta de hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) es una rápida en la manifestación in vivo de la respuesta inmune dependiente de células T a un antígeno extraño (Ag) que el sistema inmune del huésped ha experimentado en el pasado reciente. Reacciones de DTH a menudo se dividen en una fase de sensibilización, en referencia a la experiencia inicial antígeno, y una fase de desafío, que por lo general sigue varios días después de la sensibilización. La falta de una respuesta de hipersensibilidad de tipo retardado a una recuperación Ag demostrada por pruebas cutáneas a menudo se considera como una prueba de anergia. El ensayo de DTH tradicional ha utilizado con eficacia en el diagnóstico de muchas infecciones microbianas.
A pesar de compartir características inmunológicas similares, tales como la infiltración de linfocitos, edema y necrosis de los tejidos, la DTH directa no es una técnica de diagnóstico factible en pacientes trasplantados debido a la posibilidad de inyección directa que resulta en la sensibilización a los antígenos del donante y la pérdida del injerto. Para evitar este problema, el zumbidouna-a-mouse "trans-vivo" ensayo de DTH fue desarrollado 1,2. Esta prueba es esencialmente un ensayo de DTH de transferencia, en la que las células humanas mononucleares de sangre periférica (CMSP) y antígenos específicos se inyectaron por vía subcutánea en el pabellón auricular o pata de un ratón ingenuo e hinchazón DTH-como se mide después de 18-24 horas 3. La presentación de antígenos por las células presentadoras de antígenos humanos, tales como los macrófagos o DCS a las células T en el tejido altamente vascular ratón desencadena la cascada inflamatoria y atrae a las células inmunes de ratón resultantes en las respuestas de hinchazón. La respuesta es antígeno-específica y requiere sensibilización previa antígeno. Una respuesta DTH donante-reactiva positiva en el ensayo de Tv-DTH refleja que el paciente de trasplante ha desarrollado una disposición inmune proinflamatoria hacia aloantígenos de injerto.
La característica más importante de este ensayo es que también se puede utilizar para detectar células T reguladoras, que provocan la supresión transeúnte. Supresión de un espectadorRespuesta de recuerdo DTH en la presencia de antígeno del donante es característica de los receptores de trasplante con aloinjertos aceptados 2,4-14. El seguimiento de los pacientes trasplantados de alorreactividad y regulación por Tv-DTH puede identificar un subgrupo de pacientes que podrían beneficiarse de la reducción de la inmunosupresión y sin alto riesgo de rechazo o de la función renal deteriorada.
Un área prometedora es la aplicación del ensayo Tv-DTH en el monitoreo de la autoinmunidad 15,16 y también en la inmunología tumoral 17.
Protocol
1. Preparación de los linfocitos
- Recoger la sangre en tubos ACD (ácido citrato dextrosa).
- Aislar PBMC de sangre periférica humana fresca usando medio de separación de linfocitos de acuerdo con métodos estándar.
- Lavar las PBMC tres veces con PBS para eliminar las plaquetas contaminantes. Las plaquetas se encontraron para interferir con el ensayo de DTH trans-in vivo. Máxima permisible de contaminación por plaquetas preparación PBMC es ≤ 1x10 7 / inyección.
- Si hay una contaminación de células rojas de la sangre notable, lleve a cabo la lisis de glóbulos rojos usando tampón de lisis ACK después del primer lavado. Eliminar el tampón ACK por lavado 2 veces con PBS.
2. Preparación de aloantígeno
- Aislar PBMC de la sangre periférica de donantes utilizando el procedimiento mostrado anteriormente.
- Se resuspende el PBMC de donantes en PBS a una concentración de 120x10 6 células / ml (4x10 6 células / 30 l).
- Añadir 1 mM PMSF a la mezcla para evitar que la proteínala degradación.
- Someter a ultrasonidos la suspensión celular usando 1-siete segundos pulsos con un sonicador de sonda mm-2. (Nota: Mantenga el frío material y evitar burbujas excesivas Si se produce la formación de espuma, deje que la suspensión de células se sientan en el hielo por un 2-3 min.).
- Verificar la interrupción de> 90% de las células utilizando un hemocitómetro.
- Centrifugar la mezcla a 14.000 rpm a 4 ° C durante 20 min en microcentrífuga refrigerada.
- Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo Safe-Lock 2,0 ml y determinar la concentración de proteína.
3. Preparación de las células para preparaciones inyectables
- Para cada alícuota inyección 7x10 6 PBMC en tubos Safe-Lock 2,0 ml.
- Centrifugar a 6000 rpm durante un minuto en microcentrífuga y eliminar el sobrenadante.
- Resuspender las células en PBS con o sin antígenos. Ajustar el volumen de inyección de 35 l con PBS. El siguiente esquema se utiliza para inyecciones:
Control negativo: PBMC + PBS
Control Positivo: las PBMC + TT / DT (25 y mu; G / inyección)
Experimental antígeno específico de respuesta: PBMC + prueba de Ag (4-8 mg / inyección)
Experimental Reglamento de antígeno específico: prueba PBMC + Ag + TT / DT
4. Pre-medición, inyección, y después de la medición
- Anestesie CB17 ratón SCID con isoflurano. Medir el espesor de la almohadilla plantar trasera utilizando una pinza de resorte. Ponga calibrador en el centro de la almohadilla de la pata, con un borde de tocar la última almohadilla de pie del pie, para proporcionar un punto de referencia para mantener el sitio de medición consistente. Espesor almohadilla se registra cuando lectura del indicador se ha estabilizado.
- Inyecte lentamente suspensiones de células por vía subcutánea en las almohadillas de las patas de los ratones utilizando ½ cc jeringas de insulina con una aguja de calibre 28. Realizar la inyección con la aguja apuntando hacia los dedos de los pies, y el bisel hacia arriba. (Nota: asegúrese de que no hay fugas).
- 18-24 horas después de la inyección, anestesiar el ratón con la medición isoflurano y repetición de la DTH.
- Subtractuar el espesor de cada almohadilla de la pata antes de la inyección a partir del valor después de la inyección para obtener el valor de hinchamiento almohadilla de la pata, expresa los datos en unidades de 10 pulgadas -4. Calcular el antígeno específico de la hinchazón neta mediante la sustracción de control de la DTH (PBMC + PBS) a partir de los valores de hinchazón de la pata obtenidos a partir de los tratamientos (PBMC + donante aloantígeno, TT / DT, o donante aloantígeno + TT / DT). Se requiere una respuesta de control positivo recordar antígeno TT / DT de ≥ 25x10 pulgadas -4 más respuesta de fondo a PBS para que la prueba se considerará válida.
- Determinar la inhibición de respuestas de memoria en la presencia de antígenos del donante mediante la comparación de la hinchazón neta de cada inyección utilizando la siguiente fórmula:
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Representative Results
1. Evaluación de los receptores de trasplante renal para la respuesta específica de antígeno donante usando un ensayo Tv-DTH
Para probar el donante reactivo con la inmunidad celular en los receptores de trasplante renal se inyecta PBMC de estos pacientes con antígenos del donante solo o con un antígeno de recuerdo del toxoide tetánico (TT). Como células de control positivo fueron inyectados sólo con TT. Observamos tres patrones principales de hipersensibilidad de tipo retardado en los receptores de trasplante (Figura 1). Todos los pacientes respondieron fuertemente a Recall Ag (TT). Paciente # 62 muestra el patrón de regulación, caracterizado por una débil respuesta a antígeno del donante y una supresión marcada vinculado (67%) para recuperar la respuesta antígeno en la presencia de antígeno del donante. Este es el patrón que se ha encontrado para ser asociado con el órgano tolerancia del aloinjerto. Paciente # 48 exhibe un patrón no reguladora, que tiene la característica de una débil respuesta a donante, pero sin la supresión ligada (o supresión ligado <50%). Estepatrón se ha observado con frecuencia en pacientes que toman medicamentos inmunosupresores. Sin embargo, algunos pacientes que reciben fármacos inmunosupresores después del trasplante pueden mostrar donante supresión de antígeno enlazada de su respuesta DTH. Paciente # 8 exhibe el patrón de donantes sensibilizados, que se caracteriza por una alta respuesta al antígeno del donante y sin supresión vinculado. Esta respuesta se asocia con rechazo del injerto en los estudios de casos clínicos 8.
2. Papel de la regulación específica del donante en la vigilancia clínica en el trasplante renal
PBMC de sujetos incluidos en el ensayo observacional ITN507ST, ("Identificación e investigaciones mecanicistas de pacientes con trasplante renal tolerantes") se pusieron a prueba para el donante específico de la vía indirecta respuestas T reguladoras y efectoras T utilizando el ensayo de Tv-DTH y de los donantes (o donante HLA- sustituto emparejado) antígeno. Como se muestra en la Figura 2A, vía indirecta respuestas T efectoras a antígenos del donante revelaun espectro diferente entre los grupos de matrícula; hinchazón aumenta plantares como rangos estado clínico de los pacientes de los que son tolerantes a los que están rechazando crónica. PBMCs de receptores tolerantes inducida reducen o no las respuestas de DTH, mientras que PBMCs de individuos que rechazan provocaron fuertes reacciones de inflamación.
La medición de la vía anti-donante T respuesta reguladora indirecta mediante el ensayo de supresión vinculado demostrado que la regulación inmune era un mecanismo importante para la aceptación del aloinjerto renal. Figura 2B muestra una disminución en las respuestas reguladoras en el rango de más (Tol) a través de intermedio (Mono y SI) a los pacientes menos tolerantes (CR) 14.
3. Monitoreo de la autoinmunidad mediante ensayo Tv-DTH
Un área prometedora es la aplicación del ensayo Tv-DTH en el monitoreo de la autoinmunidad. BOS, un proceso de fibrosis obliterante oclusión de las vías aéreas pequeñas en eltrasplantado de pulmón, es la causa más común de insuficiencia trasplante de pulmón.
Al probar el papel de la inmunidad mediada por células al colágeno tipo V en este proceso, hemos encontrado que se observó el riesgo relativo más alto de síndrome de bronquiolitis obliterante (BOS) el desarrollo en los pacientes que desarrollaron una respuesta Tv-DTH positiva para el colágeno de tipo V en su sangre periférica.
La Figura 3 mostró que PBMCs de los receptores de trasplante de pulmón, pero no de los controles sanos o pacientes con síndrome de colágeno IV-reactiva Goodpasture después del trasplante renal, eran con frecuencia colágeno V reactiva 15.
4. Aplicación en la inmunología tumoral
Trans-vivo DTH está abriendo nuevas posibilidades en la investigación del cáncer de dar prioridad a los pacientes con cáncer de próstata de la terapia de vacunación. Dado que las células T reguladoras juegan un papel importante en el desarrollo y la progresión del cáncer, se utilizó Tv-DTH para probar la reactividad de las PBMCs de pacientes con cáncer tratados con una vacuna que codifica la fosfatasa ácida prostática ADN (PAP). Se utilizó la supresión transeúnte de respuesta a recordar antígeno para determinar si las actividades de regulación específicos de antígeno se están provocados en respuesta a la vacunación. Hemos encontrado que surgen las células T reguladoras específicas PAP-espontáneamente en algunos pacientes con cáncer de próstata, persisten durante la inmunización y prevenir la detección de PAP-respuestas efectoras específicas después de la inmunización. En algunos pacientes se identificaron las respuestas reguladas PAP-específicos de células T antes de la inmunización. Células T reguladoras preexistentes específicos para PAP pueden estar asociados con la incapacidad de desarrollar respuestas inmunes de tipo Th1 específica de antígeno después de la vacunación. Alternativamente respuestas de células T reguladoras preexistentes a PAP identificarán los pacientes propensos a desarrollar respuestas efectoras después de la inmunización múltiple. De cualquier manera, este ensayo proporciona una observación importante, ya que podría sugerir un medio para priorizar o excluir indivpacientes iDual de antígenos específicos de la evaluación de vacunas 17.
Figura 1. Ejemplos de los tres patrones principales de hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) encontrados en los receptores de trasplante renal. PBMC de pacientes se inyectaron en las almohadillas de las patas de ratones CB17 SCID, ya sea con antígeno de recuerdo (TT), antígenos del donante o con ambos antígeno de recuerdo donante +. Show es la respuesta hinchazón neta sobre el fondo.
Figura 2. . Análisis de células T vía indirecta de los sujetos inscritos en cinco grupos: gemelo, clínicamente tolerancia (Tol), la monoterapia esteroide(Mono), inmunosupresión estándar (SI) y rechazo crónico (RC) se investigaron las respuestas efectoras T (A) T y las respuestas normativas (B) mediante un ensayo Tv-DTH. Todos los paneles: Resultados individuales de cada sujeto (símbolos individuales) y el grupo de mediana (línea horizontal) con cuartiles se muestran. Se muestran diferencias significativas entre los grupos; * p <0,05, ** p <0,01 y *** p <0,001; # p = 0,04, # # p = 0,03, # # # p = 0,008.
Figura 3. Medición de colágeno tipo V-autoinmunidad específica mediante ensayo Tv-DTH. Tv-DTH respuestas PBMCs obtenidas de controles sanos, los receptores de trasplante renal con GPS o receptores de trasplante pulmonar. Todos los 3 grupos tuvieron respuestas positivas (≥ 25x10 pulgadas -4 hinchazón neto) para recordar antígeno, Col (II), un colágeno fibrilar específica al cartílago articular, no provocó una respuesta Tv-DTH en los pacientes o controles. Los receptores de trasplante renal con GPS habían elevado significa inflamación respuestas a Col (IV). Los receptores de trasplante de pulmón no respondieron a Col (IV), pero no respondieron a la Col (V).
La Figura 4. Uso de ensayo Tv-DTH para evaluar la inmunorregulación inducida por tumor. PBMC de pacientes con cáncer de próstata fueron inyectados con fosfatasa ácida prostática (PAP) solo o con antígeno de recordatorio TT / DT y como un control de antígeno específico de próstata (PSA) se inyectó con o sin recordar antígeno TT / DT. La inyección de PAP + TT / DT identificó células reguladoras específicas de antígeno PAP, como co-administración de PSA no fue capaz de suprimir una respuesta DTH para el antígeno de recuerdo TT / DT.
Figura 5. Reproducibilidad de ensayo Tv-DTH. Células criopreservadas obtener por leucoféresis en 1/15/2007 se descongelaron, se lavaron con PBS, se mezclaron con PBS o EBV o p37-TE + EBV (péptido auto) o p37-MA + EBV (péptido donante) y inyectada en las patas. Las células se analizaron en siguientes momentos: 07/29/2008, 02/23/2010, 01/09/2011, 10/11/2011, 12/15/2011.
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Discussion
El ensayo de DTH trans-vivo es una prueba de diagnóstico novela con una aplicación clínica potencial en la evaluación de las respuestas mediadas por células en trasplante, pacientes de cáncer y autoinmunes. Es valioso porque no sólo es útil en el seguimiento de las respuestas de recuerdo T efectoras, sino que también puede detectar respuestas T reguladoras. Un método confiable para detectar la regulación DTH humano puede predecir la seguridad de la retirada de inmunosupresión en los pacientes que son candidatos a la monoterapia o tolerancia ensayos.
La Tv-DTH es muy sensible para la detección de la vía indirecta de alorreconocimiento de MHC. Sin embargo TV de DTH puede ser modificado para detectar alorespuesta directa contra las moléculas MHC de donantes intactos. Para detectar donantes supresión antígeno enlazada de DTH, las células EBV-LCL que expresaban donante HLA de clase I o de clase II pueden ser co-inyectados con PBMC paciente. Cuando EBV-LCL se utilizaron como una fuente de antígeno en el ensayo de DTH, las células fueron irradiadas con rayos gamma con 10.000 rad, y 200.000 células fueron coinyectada con PBMC en la almohadilla plantar de ratones SCID.
Durante el curso del desarrollo de la Tv-DTH nos encontramos con que varias condiciones pueden afectar este ensayo. La más importante es requisito para la detección de la supresión transeúnte. Proporcionamos evidencia de que con el fin de detectar la inhibición de una DTH recordatorio en respuesta a antígeno del donante co-localizados, tanto en el sitio de desafío y la inmunocompetencia del huésped adoptiva del ratón son factores críticos que limitan la sensibilidad de la prueba de la TV-DTH. PBMC de los receptores de trasplante tolerantes mediada por la supresión transeúnte sólo cuando PBMC se inyecta en las almohadillas de las patas, y no oídos, y sólo en ratones inmunodeficientes, no inmunocompetentes 3.
Como todos los ensayos de la prueba de la TV-DTH tiene fortalezas y debilidades. Las enormes ventajas del ensayo Tv-DTH incluyen los siguientes: 1) no es muy sensible y puede detectar de manera fiable las células T reguladoras humanos, 2) que detecta las células T reguladoras por su función por tfenotipo heredera, 3) que detecta tanto Th-1 y las respuestas efectoras Th-17 4) lisados celulares crudos se pueden utilizar para detectar la regulación sin sensibilizar a los pacientes para el antígeno del donante 5) este ensayo presenta una alta reproducibilidad / estabilidad (Figura 5). Las desventajas son: 1) se requiere un número relativamente grande de las PBMC por inyección; 2) la técnica requiere una amplia formación, particularmente en el ensayo de supresión transeúnte.
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Disclosures
Los autores de este manuscrito no tienen conflictos de intereses a revelar.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer las contribuciones de AM VanBuskirk al desarrollo de nuestra comprensión de la respuesta DTH regulada en los receptores de trasplantes. Este trabajo fue apoyado subvenciones del NIH PO1AI084853 y R01AI066219-06 y la UE-patrocinado un estudio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACD tube for blood collection | BD | 02-684-26 | |
| Lymphocyte Separation Medium | Cellgro | 25-072-CV | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Cellgro | 21-031-CM | Without calcium & magnesium |
| ACK Lysis Buffer | BioWhittaker | 10-548E | |
| TT/DT or EBV | Sanofi Pasteur Inc./ Meridian Life Science, Inc. | TT/DT 25 μg/injection EBV 8 μg/injection | |
| Protease inhibitor PMSF | Sigma-Aldrich | 78830 | |
| Eosine for cell count | Sigma-Aldrich | E-6003 | |
| Alloantigen | Purified HLA antigens, synthetic allopeptides can be used instead of donor cell-free lysates | ||
| 50 ml sterile centrifuge tubes | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| 10 ml pipettes and pipettor | BD Falcon | 13-675-20 | |
| 2 ml safe-lock tubes | Costar | 3213 | |
| 1000 μl, 100 μl , 10 μl pipettes with sterile tips | |||
| Hemocytometer | Fisher | 02-671-10 | |
| Full size centrifuge and microfuge | Beckman Coulter/Eppendorf | ||
| 1/2cc or 1cc insulin syringes | Becton Dickinson | 14-826-79 | 28 gauge |
| Vibracell sonicator | Divtech Equipment Co. Sonocs Materials Inc | 2 mm probe | |
| Dial thickness gauge | Mitutoyo, Japan | ||
| SCID mice | Harlan | ||
| Isoflurane | Piramal Healthcare | Inhalant anesthesia |
References
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