Ein Verfahren für die menschliche Brust OP discard Material verarbeiten beschrieben. Verarbeiteten Gewebe, in Form von Organoiden kann unbegrenzt gelagert oder eingefroren platziert in Kultur für langfristige Wachstum werden. Dieses Verfahren ermöglicht die experimentelle Überprüfung der normalen humanen epithelialen Zellbiologie, und die Wirkungen von exogen Störungen.
Experimentelle Untersuchung der normalen humanen Mamma Epithelzelle (HMEC) Verhalten und wie normale Zellen zu erwerben abnormale Eigenschaften können durch in-vitro-Kultur-Systemen erleichtert werden, die genauer in vivo Modell Biologie. Verwendung von menschlichem gewonnenes Material zur Untersuchung zellulärer Differenzierung ist Alterung, Seneszenz, und Immortalisierung besonders vorteilhaft angesichts der vielen signifikanten Unterschiede in diesen molekularen Eigenschaften zwischen menschlichen und üblicherweise verwendet Nagerzellen 1-2. Mammazellen stellen eine bequeme Modellsystem, da große Mengen von normalen und abnormalen Geweben verfügbar sind aufgrund der Häufigkeit der Reduktion mammoplasty und Mastektomie Operationen.
Die Brustdrüse besteht aus einer komplexen Mischung von vielen verschiedenen Zelltypen, z. B. Epithel, adipöses, mesenchymalen, Endothelzellen. Die Epithelzellen sind verantwortlich für die differenzierte Mamma Funktion der Laktationund auch der Ursprung der überwiegenden Mehrheit der menschlichen Brustkrebs. Wir haben Methoden entwickelt, um Brustdrüse chirurgischen discard Gewebe in reinen epithelialen Komponenten sowie mesenchymale Zellen 3 verarbeiten. Das verarbeitete Material kann eingefroren unbegrenzt, oder initiiert in Primärkultur. Chirurgische discard Material ins Labor transportiert und manuell seziert, um für epitheliale enthaltendem Gewebe anzureichern. Nachfolgende Verdauung des sezierten Gewebes mit Kollagenase und Hyaluronidase Streifen Stromatumoren Material aus den Epithelien an der Basalmembran. Die erhaltenen kleinen Stücke der epithelialen Baum (Organoiden) kann aus dem aufgeschlossenen Stroma durch sequentielle Filtration an Membranen von festen Porengröße abgetrennt werden. Je nach Porengröße kann erhaltenen Fraktionen aus größeren duktalen / alveoläre Stücke, kleinere alveolaren Cluster oder Stromazellen werden. Wir haben überdurchschnittliches Wachstum beobachten, wenn Kulturen Organoide sind nicht als dis initiiertsociated Einzelzellen. Platzierung von Organoide in Kultur mit Low-Stress induzierenden Medien unterstützt das langfristige Wachstum von normalen HMEC mit Markern der Multiple Lineage Typen (myoepithelialen, luminale, Vorläuferzellen) 4-5. Eine ausreichende Anzahl von Zellen von einem individuellen Gewebe erhalten werden umfangreiche experimentelle Untersuchungen über standardisierte Zellansätzen sowie Abfragesignals unter Verwendung von Hochdurchsatz Modalitäten ermöglichen.
Cultured HMEC haben in einer Vielzahl von Studien, die die normalen Vorgänge, die Wachstum, Differenzierung, Altern und Seneszenz, und wie diese normalen Prozesse während unsterblich und malignen Transformation 4-15,16 verändert eingesetzt. Die Wirkungen von Wachstum in Gegenwart von extrazellulärem Matrixmaterial anderen Zelltypen und / oder 3D-Kultur kann mit Wachstums auf Kunststoff 5,15 verglichen werden. Cultured HMEC, beginnend mit normalen Zellen, bieten eine experimentell handhabbar System Faktoren, die zu untersuchenkann zu treiben oder zu verhindern menschlichen Alterung und Krebsentstehung.
Der menschliche Brustgewebe Verarbeitung hier vorgestellte Verfahren ermöglicht Gewinnung reiner Brustepithelzellen aus dem heterogenen Gemisch von Zelltypen in der menschlichen Brust. Filtration durch Poren von fester Größe ermöglicht eine Trennung von verschiedenen Fraktionen der Brustdrüse (zB duktale und duktalen-alveolären vs alveolären) aus dem aufgeschlossenen Stromazellen Matrix. Isogenen Mamma Fibroblasten erhalten, um die Epithelzellen angepasst werden. Gefrorene verdaute Material hat gute Lebensfähigkeit seit über 30 Jahren beibehalten. Diese Methode wurde erfolgreich auf alle, aber sehr faserig Mamma Gewebe gearbeitet und ist einfach durchzuführen. Andere Varianten des Brustgewebes Verarbeitung existieren, bieten keinen epithelialen Fraktionen, die als lebensfähig, sauber, oder getrennt sind. Platzierung verarbeitet Organoide in Kultur mit geringer Beanspruchung induzierenden Medien wie M87A ermöglicht langfristiges Wachstum des HMEC mit mehreren Linie Marker. HMEC die auf Kunststoff kultiviert wurden noch die Fähigkeit beibehalten Gattungente 3D-Strukturen mit normalen in vivo-ähnlichen Linie Beziehungen. Diese HMEC Kulturen eignen sich für umfangreiche experimentelle Untersuchung, einschließlich hoher Durchsatz, der normalen HMEC Verhalten und Faktoren, die zu treiben oder zu hemmen Seneszenz und Transformation kann.
The authors have nothing to disclose.
MAL, JCG und MRS werden von der NIA (R00AG033176 und R01AG040081) und Laboratory Directed Forschung und Entwicklung, US Department of Energy contract # DE-AC02-05CH11231 unterstützt.
Glass Petri dish 15 cm | VWR | 89000-308 |
Scissors 6.5″ | VWR | 82027-594 |
Forceps 8″ | VWR | 82027-436 |
Scalpels disposable | Miltex | 4-411 |
Collagenase | SIGMA | C0130 |
Hyaluronidase | SIGMA | H3506 |
Insulin | SIGMA | I5500 |
DMSO | SIGMA | D8418 |
Pennicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 |
Fungizone | Life Technologies | 15290-018 |
Polymixin B sulfate | Life Technologies | 21850-029 |
Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 26140-087 |
Trypsin 0.05% 100 ml | Life Technologies | 25300-054 |
DMEM/F12 | Life Technologies | 11039-021 |
HulaMixer | Life Technologies | 159-20D |
Cell strainer 100 μm | BD Falcon | 352360 |
Cell strainer 40 μm | BD Falcon | 352340 |
Tubes 15 ml | Greiner bio-one | 188-261 |
Tubes 50 ml | Greiner bio-one | 227-261 |
TC dishes 10 cm | Greiner bio-one | 664-160 |
TC dishes 6 cm | Greiner bio-one | 628-160 |
Cryogenic vials | Nalgene | 5000-1020 |
Heamocytometer | Hauser Scientific | 1490 |
Centrifuge | Eppendorf model | 5702 |