Un metodo per elaborare materiale mammaria umana scarto chirurgica viene descritto. Tessuti trattati, in forma di organoidi, possono essere congelati indefinitamente o posto in coltura per crescita a lungo termine. Questo metodo consente esame sperimentale di biologia umana normale delle cellule epiteliali, e gli effetti delle perturbazioni esogene.
Esame sperimentale di normale umano cellule epiteliali mammarie (HMEC) comportamento, e come le cellule normali acquisire proprietà anormali, può essere facilitato in sistemi di coltura in vitro che più accuratamente modello in biologia vivo. L'uso di materiale derivato umano per studiare la differenziazione cellulare, invecchiamento, senescenza, e immortalizzazione è particolarmente vantaggiosa dato le molte differenze significative di queste proprietà molecolari tra cellule di roditore umane e comunemente utilizzati 1-2. Cellule mammarie presentano un comodo sistema di modello perché grandi quantità di tessuti normali e anormali sono disponibili a causa della frequenza di mastoplastica riduttiva e ambulatori mastectomia.
La ghiandola mammaria è costituito da una miscela complessa di molti tipi cellulari distinti, ad esempio, epiteliale, mesenchimale, adipose, endoteliali. Le cellule epiteliali sono responsabili della funzione differenziata mammaria di lattazione,e sono anche all'origine della maggior parte dei tumori mammari umani. Abbiamo sviluppato metodi per trattare i tessuti mammari scarto chirurgica della ghiandola in puri elementi epiteliali e cellule mesenchimali 3. Il materiale trattato può essere conservato congelato a tempo indeterminato, o avviate in coltura primaria. Materiale di scarto chirurgico viene trasportato al laboratorio e manualmente sezionato per arricchire di tessuto epiteliale che lo contiene. Successiva digestione del tessuto sezionato con collagenasi e ialuronidasi materiale strisce stromale dal epiteli alla membrana basale. I pezzi risultanti piccoli dell'albero epiteliale (organoidi) può essere separato dal stroma digerito sequenziale per filtrazione su membrane di porosità fissa. A seconda delle dimensioni dei pori, frazioni possono essere ottenute costituito grandi duttali / alveolare pezzi più piccoli, cluster alveolari, o cellule stromali. Abbiamo osservato una crescita superiore in cui le culture vengono avviate come organoidi piuttosto che come dissociated singole cellule. Collocamento di organoidi nella cultura che utilizzano piccole-stress che inducono i media supporta crescita a lungo termine del HMEC normale con marcatori di lineage diversi tipi (mioepiteliali, luminale, progenitore) 4-5. Un numero sufficiente di cellule possono essere ottenute dal tessuto di un individuo per permettere ampia esame sperimentale utilizzando lotti cellulari standardizzati, nonché di interrogazione utilizzando modalità ad alto rendimento.
HMEC coltivata sono stati impiegati in una vasta gamma di studi che hanno esaminato i normali processi che regolano la crescita, la differenziazione, l'invecchiamento e la senescenza, e come questi processi normali sono stati alterati durante la trasformazione immortale e maligna 4-15,16. Gli effetti della crescita in presenza di materiale di matrice extracellulare, altri tipi cellulari, e / o di cultura 3D può essere confrontato con la crescita su plastica 5,15. HMEC Colta, a partire da cellule normali, fornire un sistema sperimentale trattabili per esaminare i fattori chepuò spingere o prevenire l'invecchiamento umano e carcinogenesi.
L'umano mammario metodo di lavorazione dei tessuti qui presentato permette di ottenere pure cellule epiteliali mammarie derivante dalla commistione eterogenea di tipi di cellule nel cuore umano. Filtrazione attraverso i pori di dimensione fissa consente la separazione delle diverse frazioni della ghiandola mammaria (ad esempio, duttale e dotto-alveolare vs alveolare) della matrice stromale digerito. Isogeniche fibroblasti mammaria può essere ottenuta per abbinare le cellule epiteliali. Congelato materiale digerito ha mantenuto una buona vitalità da oltre 30 anni. Questo metodo ha lavorato con successo su tutti i tessuti mammari, ma molto fibrosi, ed è semplice da eseguire. Altre variazioni della lavorazione dei tessuti mammario esistono che non forniscono frazioni epiteliali che sono il più vitale, pulito, o separati. Collocamento di organoidi trasformati in coltura con bassi stressanti media come M87A permette crescita a lungo termine del HMEC lignaggio con marcatori multipli. HMEC che sono state coltivate su plastica ancora mantengono la capacità di generite strutture 3D con normale in vivo-come rapporti lignaggio. Queste culture HMEC sono adatti per un'ampia indagine sperimentale, tra cui ad alto rendimento, di normale comportamento HMEC e fattori che possono inibire o spingono senescenza e trasformazione.
The authors have nothing to disclose.
MAL, JCG, e MRS sono supportati dalla NIA (R00AG033176 e R01AG040081) e dal Laboratorio di ricerca diretto e Sviluppo, US Department of Energy # contratto DE-AC02-05CH11231.
Glass Petri dish 15 cm | VWR | 89000-308 |
Scissors 6.5″ | VWR | 82027-594 |
Forceps 8″ | VWR | 82027-436 |
Scalpels disposable | Miltex | 4-411 |
Collagenase | SIGMA | C0130 |
Hyaluronidase | SIGMA | H3506 |
Insulin | SIGMA | I5500 |
DMSO | SIGMA | D8418 |
Pennicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 |
Fungizone | Life Technologies | 15290-018 |
Polymixin B sulfate | Life Technologies | 21850-029 |
Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 26140-087 |
Trypsin 0.05% 100 ml | Life Technologies | 25300-054 |
DMEM/F12 | Life Technologies | 11039-021 |
HulaMixer | Life Technologies | 159-20D |
Cell strainer 100 μm | BD Falcon | 352360 |
Cell strainer 40 μm | BD Falcon | 352340 |
Tubes 15 ml | Greiner bio-one | 188-261 |
Tubes 50 ml | Greiner bio-one | 227-261 |
TC dishes 10 cm | Greiner bio-one | 664-160 |
TC dishes 6 cm | Greiner bio-one | 628-160 |
Cryogenic vials | Nalgene | 5000-1020 |
Heamocytometer | Hauser Scientific | 1490 |
Centrifuge | Eppendorf model | 5702 |