मानव कमी mammoplasty और स्तन के ऊतकों के सेल संस्कृति के लिए प्रसंस्करण
Summary
एक मानव स्तन शल्य त्यागें सामग्री की प्रक्रिया विधि वर्णित है. Organoids के रूप में प्रसंस्कृत ऊतक, संग्रहीत किया जा अनिश्चित काल के जमे हुए या लंबी अवधि के विकास के लिए संस्कृति में रखा कर सकते हैं. इस विधि सामान्य मानव उपकला कोशिका जीव विज्ञान की प्रयोगात्मक परीक्षा, और exogenous perturbations के प्रभाव के लिए सक्षम बनाता है.
Abstract
Experimental examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated by in vitro culture systems that more accurately model in vivo biology. The use of human derived material for studying cellular differentiation, aging, senescence, and immortalization is particularly advantageous given the many significant molecular differences in these properties between human and commonly utilized rodent cells1-2. Mammary cells present a convenient model system because large quantities of normal and abnormal tissues are available due to the frequency of reduction mammoplasty and mastectomy surgeries.
The mammary gland consists of a complex admixture of many distinct cell types, e.g., epithelial, adipose, mesenchymal, endothelial. The epithelial cells are responsible for the differentiated mammary function of lactation, and are also the origin of the vast majority of human breast cancers. We have developed methods to process mammary gland surgical discard tissues into pure epithelial components as well as mesenchymal cells3. The processed material can be stored frozen indefinitely, or initiated into primary culture. Surgical discard material is transported to the laboratory and manually dissected to enrich for epithelial containing tissue. Subsequent digestion of the dissected tissue using collagenase and hyaluronidase strips stromal material from the epithelia at the basement membrane. The resulting small pieces of the epithelial tree (organoids) can be separated from the digested stroma by sequential filtration on membranes of fixed pore size. Depending upon pore size, fractions can be obtained consisting of larger ductal/alveolar pieces, smaller alveolar clusters, or stromal cells. We have observed superior growth when cultures are initiated as organoids rather than as dissociated single cells. Placement of organoids in culture using low-stress inducing media supports long-term growth of normal HMEC with markers of multiple lineage types (myoepithelial, luminal, progenitor)4-5. Sufficient numbers of cells can be obtained from one individual’s tissue to allow extensive experimental examination using standardized cell batches, as well as interrogation using high throughput modalities.
Cultured HMEC have been employed in a wide variety of studies examining the normal processes governing growth, differentiation, aging, and senescence, and how these normal processes are altered during immortal and malignant transformation4-15,16. The effects of growth in the presence of extracellular matrix material, other cell types, and/or 3D culture can be compared with growth on plastic5,15. Cultured HMEC, starting with normal cells, provide an experimentally tractable system to examine factors that may propel or prevent human aging and carcinogenesis.
Protocol
1. ऊतक प्रसंस्करण और पाचन मानव स्तन ऊतक शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं से त्यागें सामग्री के रूप में प्राप्त करते हैं. कमी mammoplasties सामान्य या सौम्य कोशिकाओं प्रदान कर सकते हैं, फाइब्रोएडीनोमा और gynecomastias सौम्य कोशिकाओं को प्रदान करने, गैर ट्यूमर स्तन ऊतकों (परिधीय या एक ट्यूमर contralateral, या चमड़े के नीचे) कोशिकाओं है कि सामान्य से युक्त microtumors सौम्य लेकर कर सकते हैं प्रदान करते हैं. सुनिश्चित करें उचित आईआरबी अनुमोदन त्यागें सामग्री प्राप्त करने के लिए पहले से मौजूद है. सभी सामग्री bloodborne रोगज़नक़ नियमों के तहत किया जाना चाहिए. बाँझ युक्त बफर या मीडिया कंटेनर (जैसे 01:01 Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम और हाम F-12) में रखें सामग्री 100 यू / एमएल पेनिसिलिन, 100 / ग्राम मिलीलीटर स्ट्रेप्टोमाइसिन, 5 ग्राम / एमएल Fungizone, 50U/ml Polymyxin बी के साथ पूरक, और 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, और परिवहन 4 में प्रयोगशाला डिग्री सेल्सियस कमी mammoplasty ऊतक या संग्रहीत किया जा सकता भेज 4 डिग्री सेल्सियस पर 72 घंटे के लिए काफी सु को प्रभावित किए बिनाbsequent सेल व्यवहार्यता. गैर कमी mammoplasty ऊतक के छोटे टुकड़े अधिक शीघ्र प्रसंस्करण की आवश्यकता हो सकती है. वसा ऊतकों, संयोजी ऊतक और रक्त वाहिकाओं के stromal मैट्रिक्स बाँझ स्केलपेल संदंश और कैंची का एक संयोजन का उपयोग कर से अलग उपकला क्षेत्रों. कट ऊतक का एक बड़ा गिलास बाँझ पकवान में कैंची और जगह के साथ टुकड़े (उदाहरण के लिए, 150 मिमी). धीरे उपकला क्षेत्रों, जो सफेद yellower stromal मैट्रिक्स में एम्बेडेड किस्में के रूप में दिखाई देते हैं, संदंश का उपयोग करने के लिए सामग्री और स्केलपेल दूर निहायत फैटी सामग्री परिमार्जन पकड़ काटना. पाचन में मदद करने के लिए, ~ 3-4 मिमी के छोटे टुकड़े एक 50 मिलीलीटर टेस्ट ट्यूब में विरोध नलियां और जगह का उपयोग करने में उपकला ऊतक में कटौती. यदि ऊतकों की बड़ी मात्रा में संसाधित किया जा रहा है, ताजा स्केलपेल ब्लेड की जरूरत हो सकती है. पकवान से निपटान के लिए संस्थागत नियमों के अनुसार फैटी सामग्री निकालें. भारी रेशेदार ऊतकों में (जैसे, चमड़े के नीचे masगंभीर fibrocystic रोग के साथ tectomies), वहाँ और अधिक ठोस सफेद, गैर उपकला सामग्री हो जाएगा. में रेशेदार matrices से उपकला कोशिकाओं टुकड़े करना यह मुश्किल हो सकता है. रेशेदार सामग्री के बड़े टुकड़े छोटे टुकड़े कि ~ क्षेत्र में 1-3 मिमी वर्ग हैं और अलग से पचा में कटौती की जा सकती है. उपकला ऊतक dissected जगह एक शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब (50 मिलीग्राम या 15 मिलीलीटर) में एक तिहाई से ट्यूब की मात्रा का कोई बड़ा शामिल ऊतक के साथ. ट्यूब लाओ पूरी मात्रा के लिए, केवल एक छोटे से हवा रोटेशन के दौरान मिश्रण के लिए अनुमति देने के लिए जगह छोड़ने, एक ऊतक पाचन मिश्रण (DME/F-12 या समकक्ष, 10 / ग्राम मिलीलीटर इंसुलिन, ऊपर के रूप में एंटीबायोटिक दवाओं, और 10 के अंतिम एकाग्रता का उपयोग % FCS, 200 कच्चे तेल यू / मिलीलीटर कोलैजिनेज और 100 hyaluronidase यू / एमएल. एक HulaMixer ट्यूब रोटेटर पर प्लेस ट्यूब और 8 रातोंरात rpm पर 37 360 ° घुमाएगी डिग्री सेल्सियस 5 मिनट के लिए 600 XG पर ट्यूबों अपकेंद्रित्र. तैरनेवाला वसा और निपटान समझौते के लिए मध्यम छोड़ेंसंस्थागत नियमों के आईएनजी. मध्यम में एक गोली के छोटे अशेष भाजक कमजोर द्वारा पाचन के पूरा करने के लिए जाँच करें. पाचन पूरा हो गया है जब सूक्ष्म परीक्षा चिकनी दिखने ductal, वायुकोशीय, या ductal वायुकोशीय संलग्न stroma (चित्रा 1 ए) से मुक्त संरचनाओं के साथ कोशिकाओं के clumps (organoids) से पता चलता है. कमी mammoplasty ऊतकों आमतौर पर एक रात में पाचन के बाद अभी भी संलग्न stroma दिखाई देगा और अतिरिक्त पाचन के समय की आवश्यकता होगी. ताजा ऊतक पाचन और रोटेशन के साथ फिर से सेते मिश्रण में अधूरे पचा गोली एक और 4-12 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर Resuspend. 1.6 और 1.7 चरणों को दोहराएँ. अगर पाचन अभी भी अधूरा है, फिर गोली और पुनः सेते 37 ° रातोंरात सी में रोटेशन के साथ पाचन मिश्रण जोड़ने. एंजाइमों की एकाग्रता के लिए अधिक पाचन रात को रोकने के लिए कम किया जा सकता है. जब पाचन पूरा हो गया है, 600 XG पर 5 मिनट के लिए ट्यूबों अपकेंद्रित्र, डाइजेस्ट aspirateआयन मिश्रण, प्लस लगभग 15 ml/50 मिलीलीटर ट्यूब, 5 ml/15 मिलीलीटर ट्यूब में मध्यम एंटीबायोटिक दवाओं में resuspend गोली. 2. निस्पंदन और पचा सामग्री की बर्फ़ीली एक बाँझ 50 मिलीलीटर ट्यूब पर एक बाँझ 100 सुक्ष्ममापी झरनी पर स्थानांतरण resuspended गोली की aliquots. ट्यूब में मध्यम नाली चलो, तो शीर्ष 1-2x समय पर मध्यम के 2-3 मिलीलीटर के साथ organoids rewash. दोहराएँ तक resuspended गोली के सभी स्थानांतरित कर दिया गया है. अगर वहाँ फिल्टर पर भी कई organoids और मध्यम अब आसानी से नालियों की हैं, शेष सामग्री के लिए एक नया फिल्टर (ओं) का उपयोग करें. ध्यान से अन्य बाँझ ट्यूब के शीर्ष पर फिल्टर (ओं) फ्लिप और ट्यूब में अधिक मध्यम के साथ organoids धोने. यह 100 सुक्ष्ममापी organoid पूल है. सामग्री है कि मूल 50 मिलीलीटर ट्यूब में सूखा लो और एक 40 सुक्ष्ममापी झरनी का उपयोग 2.1 की प्रक्रिया को दोहराने, 40 सुक्ष्ममापी organoid पूल, है जिसमें ज्यादातर वायुकोशीय संरचनाओं प्राप्त. सामग्री है कि वें में सूखाई ट्यूब छानना पूल, जो mesenchymal और उपकला कोशिकाओं और vasculature की छोटे टुकड़े के एक छोटे / clumps गठन किया. गोली 100 सुक्ष्ममापी, 40 सुक्ष्ममापी, 5 मिनट के लिए 600 XG पर और छानना पूल. तैरनेवाला reconstitute, सीपीएम द्वितीय (DME/F-12 या 44% FCS और 6% DMSO के साथ बराबर) में प्रत्येक ट्यूब पैक गोली के 0.1 मिलीग्राम प्रति CPMII के लगभग 1 मिलीलीटर का उपयोग Aspirate. 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें 3.2 नीचे के रूप में एक 35 मिमी टिशू कल्चर प्लास्टिक पकवान ड्रॉप में ड्रॉप द्वारा resuspended सामग्री के 0.1 मिलीलीटर रखने 2 organoid पूल के लिए एक परीक्षण पकवान बीज. छानना पूल सीधे fibroblast मध्यम (DME/F-12 या 10 ग्राम / मिलीलीटर इंसुलिन और 10% FBS के साथ बराबर) के साथ किया जा सकता है टिशू कल्चर प्लास्टिक पर वरीयता दी गई है. अशेष भाजक Nunc प्रकार ठंड ampoules (1/2 मिलीलीटर मिलीलीटर ampoule) में शेष resuspended सामग्री. -80 डिग्री सेल्सियस में रात भर रुक और फिर तरल नाइट्रोजन में भंडारण के लिए तुरंत हस्तांतरण. हम व्यवहार्यता का कोई खास नुकसान नहीं मनाया हैहमारे मूल ampoules में संग्रहीत देर से 1970 के बाद से जमे हुए है. 3. जमे हुए Organoids और प्राथमिक संस्कृति की subculture सीडिंग जल्दी से जमे हुए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी में स्नान organoids युक्त ampoule पिघलना करने के लिए. 2 से 10 (आमतौर पर 6 ~) 60 मिमी व्यंजन, या 1-3 100 मिमी व्यंजन, ampoule में organoids की संख्या के दृश्य आकलन पर निर्भर करता है में organoids बीज. लगभग 20-40 60 मिमी पकवान प्रति वरीयता प्राप्त organoids इष्टतम है. Thawed organoids ध्यान रखा गया है, ड्रॉप द्वारा ड्रॉप, डिश सतह पर organoids की एक भी वितरण के लिए एक 1 मिलीलीटर विंदुक या पाश्चर विंदुक के साथ. Organoids रखा करीब एक साथ परिणाम के लिए सीमित स्थान है, subculture या ठंड के लिए कम कोशिकाओं को जन्म दे रही है. पकवान सतह scratching (कोशिकाओं को पिछले खरोंच सतहों से विकास करते हैं) से बचें. देते हैं और फिर धीरे धीरे मध्यम विकास जोड़ने के लिए (जैसे 2-3 ml/60 मिमी पकवान) organoids dislodging से बचने organoids की अनुमति के लिए 1-2 मिनट रुको. मैं37 डिग्री humidified सीओ 2 इनक्यूबेटर में सी ncubate. प्राथमिक संस्कृतियों हैं. वर्तमान में हम सबसे मजबूत HMEC विकास (2 चित्रा) के लिए M87A + ऑक्सीटोसिन मध्यम (एक्स) का उपयोग करें. 1 दिन के बाद जांच, कि organoids जुड़े होते हैं. अतिरिक्त मध्यम (जैसे 2-3 ml/60 मिमी पकवान) जोड़ें. सेल organoids से प्रवास 24-48 घंटा, बोने के बाद 48-72 घंटा (चित्रा 1 बी, सी) और mitotic परिणाम दिखाई जानी चाहिए. 24 घंटे के बाद कभी कभी लगाव गरीब है, खासकर अगर बड़ी उम्र की महिलाओं से overdigested organoids या organoids चढ़ाना, लेकिन ज्यादातर तैयारी 72 घंटा के भीतर संलग्न करना होगा. Vasculature की छोटे टुकड़े देते हैं और fibroblast सेल परिणाम (चित्रा 1D) को जन्म दे सकता है. संस्कृतियों के प्रति सप्ताह कम से कम 3 बार खिलाओ. M87A – प्रकार मीडिया में विकसित कोशिकाओं को 5-8 दिनों के भीतर निकट संगम बढ़ने, बोने के घनत्व के आधार पर. अगर वहाँ महत्वपूर्ण fibroblast वृद्धि, विभेदकों Trypsinization (डीटी) के आधार पर हैसतह प्लास्टिक से fibroblasts की तेजी टुकड़ी, fibroblasts निकालने की जरूरत है. जब उपकला पैच है Ste (खारा, 0.05% trypsin EDTA 0.02%), Aspirate के साथ बड़े, Aspirate मीडिया, धोने के पकवान (जैसे, 1-2 ml/60 मिमी पकवान) हो जाते हैं, ताजा 0.5 मिलीलीटर Ste जोड़ने और कमरे के तापमान पर छोड़ सतत सूक्ष्म अवलोकन के साथ लगभग 1 मिनट के लिए. जब fibroblasts अलग लेकिन उपकला कोशिकाओं पक्षपाती अभी भी कर रहे हैं, लेकिन धीरे तेजी से एक कठिन सतह के खिलाफ पकवान की ओर दस्तक fibroblasts हटाना और फिर जल्दी से aspirate. पीबीएस के साथ एक बार धोएं, और फिर aspirate. भारी fibroblasts के साथ दूषित संस्कृति एक अतिरिक्त डीटी की आवश्यकता हो सकती है. प्राथमिक संस्कृतियों है जब बड़े उपकला पैच मौजूद हैं subculture, लेकिन संगम से पहले. organoid बोने और लगाव के घनत्व की आवश्यकता समय को प्रभावित करती है. प्राथमिक संस्कृति को बनाए रखने और एकाधिक माध्यमिक संस्कृतियों, समय पर स्थान दिया गया है उत्पन्न करने के लिए, हम आंशिक Trypsinizations (पीटी) करते हैं. Aspirate मीडिया, 1-2 मिलीलीटर Ste के साथ एक 60 मिमी पकवान धोने, 0.5 मिलीग्राम ताजा Ste जोड़ने के लिए पकवान. 1-5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर खुर्दबीन के नीचे पकवान की कोमल दस्तक सेल टुकड़ी को बढ़ावा देने के साथ सेल टुकड़ी का निरीक्षण करें. Trypsinization बंद कर दिया जा सकता है जब ~ कोशिकाओं का 50% अलग है चाहिए. अर्ली अंक आमतौर पर तेजी से सेल टुकड़ी है. बाद में अंक के लिए, कोशिकाओं तेजी टुकड़ी के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है, सावधान निगरानी के साथ, के रूप में सभी कोशिकाओं से जल्दी आ सकता है. डिश के लिए सीरम युक्त मीडिया के 2 मिलीलीटर जोड़ें, repipette धो लो, करने के लिए और एक बाँझ 15 मिलीलीटर ट्यूब स्थानांतरण. एक और ~ 1-2 मिलीलीटर मीडिया के साथ 2x दोहराएँ, ट्यूब को धोने जोड़ने. प्राथमिक पकवान Refeed और इनक्यूबेटर में लौटने. ट्यूब में रुधिरकोशिकामापी साथ कोशिकाओं गिनो. बार subcultured, कोशिकाओं कोई लो, अंक प्राथमिक subcultured या फ्रोजन secondaries (2 बीतने के कोशिकाओं secondaries कहा जाता है और बराबर लंबी अवधि के विकास बर्तन में अच्छी सेल regrowth के साथ 4 से 8 बार दोहराया जा सकता हैnger प्राइमरी). एक बार organoid सामग्री प्राथमिक संस्कृतियों में मौजूद नहीं रह गया है, subcultured secondaries लंबी अवधि जनसंख्या दुगनी क्षमता में गिरावट दिखा. Secondaries के लिए subculture के लिए, बीज कोशिकाओं को सीधे बर्तन में ट्यूब से. 1-2 x 10 5 cells/100 मिमी M87A + एक्स के रूप में एक मजबूत माध्यम में पकवान की सीडिंग 4-7 दिनों में संगम के लिए नेतृत्व करेंगे. हम मध्यम के लिए 2 पारित में हैजा विष proliferative क्षमता में वृद्धि जोड़ने, हैजा विष प्राथमिक संस्कृति में छोड़ दिया जाता है, क्योंकि यह organoids से multilayered सेल परिणाम होता है. ठंड के लिए secondaries के रूप में, 5 मिनट और 10 6 कोशिकाओं / एमएल के एक अंतिम घनत्व के साथ resuspend CPMII में के लिए 600 XG पर गोली ट्यूब. अशेष भाजक Nunc प्रकार ठंड ampoules में कोशिकाओं resuspended -80 में रातोंरात फ्रीज डिग्री सेल्सियस और फिर तरल नाइट्रोजन में भंडारण के लिए तुरंत हस्तांतरण. यह सुरक्षित करने के लिए 1 पीटी से कोशिकाओं को फ्रीज करने के लिए सिफारिश की है, औरsubculture के लिए 2 पीटी से कोशिकाओं का उपयोग करें. अतिरिक्त अंक भविष्य में उपयोग के लिए जमे हुए संग्रहीत किया जा सकता है.
Representative Results
ऊतकों के लिए प्रतिनिधि आंकड़े उचित organoids पचा और संस्कृति में रखा चित्र 1 में दिखाया जाता है. अधूरे पचा ऊतक दिखा देंगे सामग्री अभी भी इन संरचनाओं के बाहर से जुड़ा है, और संभावना प्राथमिक संस्कृति में कुछ तंतुप्रसू संबंधी सेल के विकास होगा, डीटी को दूर करने के लिए आवश्यकता होती है. Overdigested ऊतक कम चिकनी बाहरी सीमाओं को दिखाने के लिए, और लंबे समय तक लेने के लिए प्राथमिक संस्कृति में संलग्न कर सकते हैं. उपकला परिणाम 48-72 घंटा (1 बी, सी) के भीतर शुरू करना चाहिए. Vasculature (1D) के छोटे टुकड़े mesenchymal सेल परिणाम के एक स्रोत हो सकता है. उपकला outgrowths morphologically विषम आबादी proliferative आबादी है कि myoepithelial, पूर्वज, और luminal प्रजातियों (1E, 3C – ई) के साथ जुड़े मार्कर के साथ कोशिकाओं के मिश्रण होते हैं के साथ दिखाते हैं. हैजा विष और ऑक्सीटोसिन के साथ पूरक M87A के रूप में कम तनाव मीडिया में वृद्धि बेहतर लंबी अवधि का समर्थन करेगासामान्य पूर्व ठहराव HMEC की वृद्धि की तुलना में पिछले मीडिया योगों (2 चित्रा). M87A प्रकार मीडिया भी luminal और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के मार्ग के माध्यम से विकास का समर्थन 4-8 (3C-E आंकड़े, 4), उसके बाद, सबसे कोशिकाओं केवल myoepithelial वंश मार्करों बताते हैं. प्लास्टिक पर सभ्य HMEC उनके लिए उचित आत्म संगठन micropatterned 3 डी microwells में 3 डी फार्म की क्षमता बनाए रखने के लिए, luminal myoepithelial कोशिकाओं (चित्रा -4 ए, बी) के लिए आंतरिक कोशिकाओं के साथ कर सकते हैं, और संगठित संरचनाओं फार्म जब Matrigel (4C, डी) में चढ़ाया. चित्रा 1. HMEC organoids और प्राथमिक संस्कृति (ए) Organoid पाचन और छानने के बाद ductal वायुकोशीय संरचना दिखा. (बी, सी) प्राथमिक संस्कृति में नियुक्ति के बाद 2 दिन ductal और वायुकोशीय संरचना दिखा Organoids शुरुआत सेल outgr नोटowth (सफेद तीर). (डी) लघु रक्त वाहिका और एक ही संस्कृतियों से बी, सी. fibroblast परिणाम के रूप में शुरू करने के साथ संलग्न (ई) 4 दिनों के बाद प्राथमिक organoid संस्कृति से उपकला सेल परिणाम. प्रजातियों K14 (लाल) और K19 (हरा) एंटीबॉडी के साथ धुंधला द्वारा की पहचान कर रहे हैं, नाभिक DAPI (नीला) के साथ दाग थे. Myoepithelial Luminal (+ K14-/K19, हरे), (K14-K19, + / लाल), और पूर्वज (K14 + / K19 +, पीला) कोशिकाओं को दिखाई दे रहे हैं. बेदाग कोशिकाओं organoid अधूरा एंटीबॉडी प्रवेश करने के लिए कारण कोर में मनाया जाता है. चित्रा 2. विभिन्न मीडिया योगों में HMEC संस्कृतियों के विकास से प्राप्त एक व्यक्ति, 184 नमूना Organoids प्राथमिक संस्कृति में विभिन्न मीडिया योगों का उपयोग शुरू किया गया. सर्वश्रेष्ठ लंबी अवधि के विकास के हमारे सबसे हाल ही में निर्माण, M87A + (एक्स) ऑक्सीटोसिन 4 का उपयोग कर प्राप्त किया जाता है. इस माध्यम का भी समर्थन करता हैकई HMEC प्रजातियों के विकास (चित्र 1E देखें). एक पहले मीडिया सूत्रीकरण, 3 मिमी कम मजबूत वृद्धि प्रदान की है, जबकि एक सीरम मुक्त मीडिया, MCDB170 (वाणिज्यिक MEGM) cyclin kinase अवरोध p16 Ink4a की तेजी से प्रेरण और न्यायपालिका कोशिकाओं 7,11,13 के लिए चयन करने के लिए 17 होता है. चित्रा 3. वंश विविधता के असभ्य organoids और EpCAM और CD49f/alpha 6 Integrin (ए) की अभिव्यक्ति है, और (ख) CD227/Muc1 के लिए सुसंस्कृत HMEC 4 पारित. वें (ए, बी) एक असभ्य, enzymatically dissociated organoid FACS विश्लेषण में तुलना और CD10/CALLA. (सी, डी) (सी) EpCAM और CD49f/alpha 6 Integrin की अभिव्यक्ति के लिए 4 वें पारित होने के पूर्व ठहराव HMEC FACS विश्लेषण, और (डी) CD227/Muc1 और CD10/CALLA. पहचाने जाने योग्य पीएलईपी (luminal मार्करों EpCAM CD227 या व्यक्त), एमईपी (myoepithelial मार्करों CD49f या CD10 व्यक्त), या ठेला (+ / EpCAM + आबादी में समृद्ध CD49f) के रूप में opulations लेबल रहे हैं. ध्यान दें कि EpCAM और CD49f परिवर्तन की संस्कृति के विनियमन के लिए अनुकूलन के दौरान असभ्य organoids की तुलना में. (ई) क्रमित किए बिना HMEC और FACS समृद्ध एलईपी और 4 वें पारित में एमईपी K14 केरातिन (एमईपी मार्कर) और K19 (एलईपी मार्कर) immunofluorescence विश्लेषण वंश पहचान सत्यापित करने के लिए दाग. DAPI साथ नाभिक दाग नीले रंग दिखाई देते हैं. चित्रा 4. संवर्धित HMEC vivo तरह वंश संबंधों जब उपयुक्त microenvironments में रखा के साथ संगठित संरचनाओं बनाने में सक्षम हैं. (ए) पूर्व ठहराव 4 वें पारित होने HMEC FACS समृद्ध मैं थेNto luminal एलईपी और myoepithelial एमईपी प्रजातियों CD227 और CD10 के लिए मार्कर का उपयोग करते हुए, इन प्रजातियों के साथ K14 और K19 की अभिव्यक्ति द्वारा सत्यापित () नहीं दिखाया. (बी) जब micropatterned microwells में एक साथ मिश्रित, संवर्धित कोशिकाओं एमईपी साथ बाहर और एलईपी आंतरिक पर bilayers में आत्म संगठन में सक्षम थे [गीत एट अल से अनुकूलित 5.]. Fluorescently लेबल (हरा) एलईपी और एमईपी (लाल) एक confocal खुर्दबीन 0 घंटा, 24 घंटा, और microwells (ऊपरी) के अलावा के बाद 48 घंटे के साथ imaged थे. नियंत्रण HMEC मनमाने ढंग से लाल या हरी फ्लोरोसेंट लेबल (कम) के साथ लेबल रहे थे. (सी) FACS समृद्ध पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं की तेज क्षेत्र छवि (cKit +) 3 डी संस्कृति (Matrigel) में चढ़ाया और 18 दिनों के लिए हो रहा है. परिणामस्वरूप संरचनाओं वायुकोशीय morphogenesis प्रदर्शन कर सकते हैं. (D) संरचनाएं Matrigel से निकाले गए थे और K14 और K19 का पता लगाने के लिए दाग, नाभिक DAPI के साथ counterstained थे. Immunofluorescent विश्लेषण सही luminal और बेसल pola के साथ आयोजित संरचनाओं से पता चलता हैrity.
Discussion
मानव स्तन ऊतक प्रसंस्करण यहाँ प्रस्तुत पद्धति मानव स्तन में सेल प्रकार की विषम मिश्रण से शुद्ध स्तन उपकला कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए सक्षम बनाता है. निश्चित आकार के pores के माध्यम से निस्पंदन स्तन ग्रंथि के पचा stromal मैट्रिक्स से अलग भिन्न (जैसे, वाहिनीपरक और ductal वायुकोशीय बनाम वायुकोशीय) की जुदाई की अनुमति देता है. Isogenic स्तन fibroblasts उपकला कोशिकाओं से मिलान करने के लिए प्राप्त किया जा सकता है. जमे हुए पच सामग्री 30 से अधिक वर्षों के लिए अच्छा व्यवहार्यता बनाए रखा गया है. इस विधि को सफलतापूर्वक सभी लेकिन बहुत रेशेदार स्तन ऊतकों पर काम किया है, और सरल करने के लिए है. स्तन ऊतक प्रसंस्करण के अन्य रूपों मौजूद है है कि उपकला fractions है कि व्यवहार्य के रूप में, स्वच्छ, या अलग हैं प्रदान नहीं करते हैं. M87A के रूप में कम तनाव उत्प्रेरण मीडिया के साथ संस्कृति में संसाधित organoids की नियुक्ति HMEC के कई वंश मार्कर के साथ लंबी अवधि के विकास की अनुमति देता है. HMEC कि प्लास्टिक पर संवर्धित किया गया है अभी भी genera करने की क्षमता बनाए रखने केते vivo तरह वंश संबंधों में सामान्य के साथ 3 डी संरचनाओं. ये HMEC संस्कृतियों उच्च throughput सहित व्यापक प्रयोगात्मक, सामान्य HMEC व्यवहार और कारक है कि प्रेरित करना या senescence और परिवर्तन को बाधित कर सकते हैं की जांच के लिए उपयुक्त हैं.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
मल, JCG, और मिसेज एनआईए (R00AG033176 और R01AG040081) और प्रयोगशाला निर्देशित अनुसंधान और विकास, अमेरिका डे AC02 – 05CH11231 # ऊर्जा अनुबंध की विभाग द्वारा समर्थित हैं.
Materials
| Glass Petri dish 15 cm | VWR | 89000-308 |
| Scissors 6.5″ | VWR | 82027-594 |
| Forceps 8″ | VWR | 82027-436 |
| Scalpels disposable | Miltex | 4-411 |
| Collagenase | SIGMA | C0130 |
| Hyaluronidase | SIGMA | H3506 |
| Insulin | SIGMA | I5500 |
| DMSO | SIGMA | D8418 |
| Pennicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 |
| Fungizone | Life Technologies | 15290-018 |
| Polymixin B sulfate | Life Technologies | 21850-029 |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 26140-087 |
| Trypsin 0.05% 100 ml | Life Technologies | 25300-054 |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11039-021 |
| HulaMixer | Life Technologies | 159-20D |
| Cell strainer 100 μm | BD Falcon | 352360 |
| Cell strainer 40 μm | BD Falcon | 352340 |
| Tubes 15 ml | Greiner bio-one | 188-261 |
| Tubes 50 ml | Greiner bio-one | 227-261 |
| TC dishes 10 cm | Greiner bio-one | 664-160 |
| TC dishes 6 cm | Greiner bio-one | 628-160 |
| Cryogenic vials | Nalgene | 5000-1020 |
| Heamocytometer | Hauser Scientific | 1490 |
| Centrifuge | Eppendorf model | 5702 |
References
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LaBarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture. J. Vis. Exp. (71), e50011, doi:10.3791/50011 (2013).