Analyse der Solvent Zugänglichkeit des Cystein Rückstände auf<em> Mais rayado fino-Virus</em> Virus-ähnliche Partikel Produziert in<em> Nicotiana benthamiana</em> Pflanzen und Vernetzung der Peptide an VLPs
Summary
Ein Verfahren, um das Lösungsmittel Zugänglichkeit der Thiolgruppe von Cystein-Resten der Analyse<em> Mais rayado fino-Virus</em> (MRFV)-Virus-ähnliche Partikel (VLP) durch ein Peptid Vernetzungsreaktion folgt beschrieben. Das Verfahren nutzt die Verfügbarkeit von mehreren chemischen Gruppen auf der Oberfläche der VLPs, die als Ziele für spezielle Reaktionen sein kann.
Abstract
Imitieren und Nutzung Virus Eigenschaften und physikalisch-chemischen und physikalischen Eigenschaften verspricht, um Lösungen für einige der weltweit dringlichsten Herausforderungen. Die schiere Reichweite und Arten von Viren mit ihren faszinierenden Eigenschaften gekoppelt potenziell geben unendlich viele Möglichkeiten für Anwendungen in der Virus-basierten Technologien. Viren haben die Fähigkeit, zu Teilchen mit diskreten Form und Größe, Spezifität Symmetriegründen polyvalence und stabile Eigenschaften in einem weiten Bereich von Temperatur und pH-Bedingungen selbst zusammen. Es überrascht nicht, mit einer solchen Reihe von bemerkenswerten Eigenschaften, werden Viren zur Verwendung in Biomaterialien 9, Impfstoffen 14, 15, elektronische Materialien, chemische Werkzeuge und molekularen elektronischen Behälter 4, 5, 10, 11, 16, 18, 12 vorgeschlagen.
Um Viren in der Nanotechnologie zu verwenden, müssen sie aus ihren natürlichen Formen modifiziert werden, um neue Funktionen zu verleihen. Diese anspruchsvolle prozess kann durch verschiedene Mechanismen, einschließlich genetischer Modifikation des viralen Genoms und chemisch Anbringen fremden oder gewünschten Moleküle an die Viruspartikel reaktiven Gruppen 8 durchgeführt werden. Die Fähigkeit, einen Virus zu modifizieren vorwiegend abhängig von den physikalisch-chemischen und physikalischen Eigenschaften des Virus. Darüber hinaus müssen die genetische oder physiochemischen Modifikationen ohne Beeinträchtigung der nativen Struktur Virus und Virus-Funktion ausgeführt werden. Maize rayado fino Virus (MRFV) Hüllproteinen in Escherichia coli Herstellung stabiler und leere VLPs, die durch Protein-Protein stabilisiert sind selbstorganisieren Interaktionen und die in Virus-basierten Technologien Anwendungen 8 verwendet werden. VLPs in Tabakpflanzen hergestellt wurden als ein Gerüst, auf dem eine Vielzahl von Peptiden kovalent angezeigt werden 13 untersucht. Hier beschreiben wir die Schritte 1) bestimmen, welche der Lösungsmittel-zugänglichen Cysteine in einem Virus-Kapsid sind für ModifikationenKation, und 2) Bioconjugate Peptide an den modifizierten Kapside. Durch die Verwendung von nativem oder durch Mutation eingefügten Aminosäurereste und Standardkoppelstellen Technologien haben eine breite Vielfalt von Materialien auf der Oberfläche von Pflanzenviren wie Brome Mosaic Virus 3, Carnation-Mottle-Virus 12, Cowpea chlorotic mottle virus 6, Tabak Mosaik angezeigt worden Virus 17, Turnip yellow mosaic virus 1 und MRFV 13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das hier vorgestellte Verfahren erlaubt eine sehr empfindliche und schnelle Analyse von reaktiven Cysteine auf der Oberfläche der Pflanzen produzierte VLPs sowie auf anderen Proteinkomplexen. Maleimide sind Thiol-spezifische Reagenzien, die mit freien Sulfhydryl enthaltenden Molekülen reagieren, um eine stabile Thioether-Bindungen zu bilden. Diese Methode stützt sich auf die Spezifität der Maleimide mit Sulfhydrylgruppen nicht in Wechselwirkungen mit anderen Aminosäuren beteiligt reagieren. Die Erhaltung der …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| Thinwall, Ultra-Clear Tubes | Beckman | 344059 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 Kit | Life Tecnologies | AM1344M | |
| Fluorescein-5-Maleimide | Thermo Scientific Life Technologies | 46130 F150 | 46130 is out of order substitute with F150 |
| Pierce Biotin Quantitation Kit | Thermo Scientific | 28005 | |
| EZ-Link Maleimide-PEG2-Biotin, No-Weigh Format | Thermo Scientific | 21901 | |
| SM(PEG)n Crosslinkers | Thermo Scientific | 22107 | |
| 10-20% Tris-Glycine gel | Invitrogen | EC61352 | |
| Laemmli Buffer | Bio-Rad | 1610737 | |
| Tris Glycine SDS Running Buffer | Invitrogen | LC2675 | |
| Tris Glycine Transfer Buffer | Invitrogen | LC3675 | |
| Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich | Invitrogen | LC2001 | |
| Phosphatase Labeled Affinity Purified Antibody to Rabbit IgG | Kirkegaard and Perry Laboratories | 0751516 | |
| NBT/BCIP Phosphatase Substrate | Kirkegaard and Perry Laboratories | 508107 |
References
- Barnhill, H., Reuther, R., Ferguson, P. L., Dreher, T. W., Wang, Q. Turnip yellow mosaic virus as a chemoaddressable bionanoparticle. Bioconj. Chem. 18, 852-859 (2007).
- Chapman, S., Kavanagh, T., Baulcombe, D. Potato virus X as a vector for gene expression in plants. Plant J. 2, 549-557 (1992).
- Chen, C., Kwak, E. S., Stein, B., Kao, C. C., Dragnea, B. Packaging of gold particles in viral capsids. J. Nanosci. Nanotechnol. 5, 2029-2033 (2005).
- Fowler, C. E., Shenton, W., Stubbs, G., Mann, S. Tobacco mosaic virus liquid crystals as templates for the interior design of silica mesophases and nanoparticles. Advanced Materials. 13, 1266-1269 (2001).
- Gazit, E. Use of biomolecular templates for the fabrication of metal nanowires. FEBS. J. 274, 317-322 (2007).
- Gillitzer, E., Wilts, D., Young, M., Douglas, T. Chemical modification of a viral cage for multivalent presentation. Chem. Commun. , 2390-2391 (2002).
- Hammond, R. W., Hammond, J. Maize rayado fino virus capsid proteins assemble into virus-like particles in Escherichia coli. Virus Res. 147, 208-215 (2010).
- Hermamson, G. T. . Bioconjugate techniques. , (1991).
- Kaiser, C. R., Flenniken, M. L., Gillitzer, E., Harmsen, A. L., Harmsen, A. G., Jutila, M. A., Douglas, T., Young, M. J. Biodistribution studies of protein cage nanoparticles demonstrate broad tissue distribution and rapid clearance in vivo. Int. J. Nanomed. 2, 715-733 (2007).
- Knez, M., Bittner, A. M., Boes, F., Wege, C., Jeske, H., Maisse, E., Kern, K. Biotemplate synthesis of 3-nm nickel and cobalt nanowires. Nano Lett. 3, 1079-1082 (2003).
- Lee, S. Y., Culver, J. N., Harris, M. T. Effect of CuCl2 concentration on the aggregation and mineralization of Tobacco mosaic virus biotemplate. J. Colloid. Interface. Sci. 297, 554-560 (2006).
- Lvov, Y., Haas, H., Decher, G., Mohwald, H., Mikhailov, A., Mtchedlishvily, B., Morgunova, E., Vainshtein, B. Successive deposition of alternate layers of polyelectrolytes and a charged virus. Langmuir. 10, 4232-4236 (1994).
- Natilla, A., Hammond, R. W. Maize rayado fino virus virus-like particles expressed in tobacco plants: a new platform for cysteine selective bioconjugation peptide display. J. Virol. Methods. 178, 209-215 (2011).
- Rae, C. S., Khor, I. W., Wang, Q., Destito, G., Gonzalez, M. J., Singh, P., Thomas, D. M., Estrada, M. N., Powell, E., Finn, M. G., Manchester, M. Systemic trafficking of plant virus nanoparticles in mice via the oral route. Virology. 343, 2224-2235 (2005).
- Raja, K. S., Wang, Q., Gonzalez, M. J., Manchester, M., Johnson, J. E., Finn, M. G. Hybrid virus-polymer materials. Synthesis and properties of PEG-decorated Cowpea mosaic virus. Biomacromolecules. 4, 472-476 (2003).
- Royston, E., Lee, S. Y., Culver, J. N., Harris, M. T. Characterization of silica-coated Tobacco mosaic virus. J. Colloid Interface Sci. 298, 706-712 (2006).
- Schlick, T. L., Ding, Z., Kovacs, E. W., Francis, M. B. Dual-surface modification in the Tobacco mosaic virus. J. Am. Chem. Soc. 127, 3718-3723 (2005).
- Young, M., Willits, D., Uchida, M., Douglas, T. Plant viruses as biotemplates for materials and their use in nanotechnology. Annu. Rev. Phytopathol. 46, 361-384 (2008).
