Анализ растворителей доступность остатков цистеина на<em> Кукуруза rayado Fino вирус</em> Вирус типа частиц, образующихся в<em> Nicotiana benthamiana</em> Растения и Перекрестное связывание пептидов VLPs
Summary
Метод анализа растворителей доступность тиоловые группы остатков цистеина в<em> Кукуруза rayado Fino вирус</em> (MRFV)-вирус типа частиц (VLP), а затем пептида реакции сшивания описано. Метод использует преимущества наличия нескольких химических групп на поверхности ВПЧ, которые могут стать мишенью для конкретной реакции.
Abstract
Имитация и эксплуатации вирус свойства и физико-химические и физические характеристики держит обещание дать ответы на некоторые из наиболее актуальных проблем в мире. Сам диапазон и типы вирусов в сочетании с их интригующими свойствами потенциально дают бесконечные возможности для применения в вирус-технологий. Вирусы имеют возможность самостоятельно собираться в частицы с дискретной формы и размера, специфики симметрии, поливалентности и стабильные свойства в широком диапазоне температур и рН условиях. Не удивительно, что с таким замечательным набором свойств, вирусы предложены для использования в биоматериалов 9, вакцины 14, 15, электронных материалов, химических средств и молекулярных электронных контейнеров 4, 5, 10, 11, 16, 18, 12.
Для того чтобы использовать вирусы в области нанотехнологий, они должны быть изменены с их естественной формы, чтобы придать новые функции. В этом сложном пр.ocess может осуществляться посредством нескольких механизмов, включая генетические модификации вирусного генома и химически крепления иностранной или желаемой молекулы вирусной частицы реактивные группы 8. Возможность изменять вирус в первую очередь зависит от физико-химических и физических свойств вируса. Кроме того, генетические или физико-химические изменения должны быть выполнены без ущерба для нативной структуры вируса и вируса функции. Кукурузы rayado Fino вируса (MRFV) белков пальто самостоятельно собираться в кишечной палочки получения стабильных и пустые ВПЧ, которые стабилизировать белок-белковых взаимодействий и которые могут быть использованы в вирусных технологий на основе применения 8. VLPs производится в растениях табака были рассмотрены как эшафот, на котором различные пептиды могут быть ковалентно отображается 13. Здесь мы описываем шаги: 1) определить, какие из доступных растворителей цистеина в капсид вируса доступны для модификацийкатионов, и 2) Bioconjugate пептидов изменение капсид. С помощью родных или мутационно вставлен аминокислотных остатков и стандартных технологий связи, широкий спектр материалов были выставлены на поверхности вирусов растений, таких как, Brome вируса мозаики 3, гвоздика пятнистости вируса 12, Вигну хлоротичных пятнистости вирус 6, табачной мозаики Вирус 17, репа вирус желтой мозаики 1, и MRFV 13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Метод, представленный здесь, дает очень чувствительный и быстрый анализ реактивных цистеина, присутствующего на поверхности растений производства VLP, а также на других белковых комплексов. Малеимиды являются тиол-специфических реагентов, которые вступают в реакцию с свободных сульфг…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| Thinwall, Ultra-Clear Tubes | Beckman | 344059 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 Kit | Life Tecnologies | AM1344M | |
| Fluorescein-5-Maleimide | Thermo Scientific Life Technologies | 46130 F150 | 46130 is out of order substitute with F150 |
| Pierce Biotin Quantitation Kit | Thermo Scientific | 28005 | |
| EZ-Link Maleimide-PEG2-Biotin, No-Weigh Format | Thermo Scientific | 21901 | |
| SM(PEG)n Crosslinkers | Thermo Scientific | 22107 | |
| 10-20% Tris-Glycine gel | Invitrogen | EC61352 | |
| Laemmli Buffer | Bio-Rad | 1610737 | |
| Tris Glycine SDS Running Buffer | Invitrogen | LC2675 | |
| Tris Glycine Transfer Buffer | Invitrogen | LC3675 | |
| Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich | Invitrogen | LC2001 | |
| Phosphatase Labeled Affinity Purified Antibody to Rabbit IgG | Kirkegaard and Perry Laboratories | 0751516 | |
| NBT/BCIP Phosphatase Substrate | Kirkegaard and Perry Laboratories | 508107 |
References
- Barnhill, H., Reuther, R., Ferguson, P. L., Dreher, T. W., Wang, Q. Turnip yellow mosaic virus as a chemoaddressable bionanoparticle. Bioconj. Chem. 18, 852-859 (2007).
- Chapman, S., Kavanagh, T., Baulcombe, D. Potato virus X as a vector for gene expression in plants. Plant J. 2, 549-557 (1992).
- Chen, C., Kwak, E. S., Stein, B., Kao, C. C., Dragnea, B. Packaging of gold particles in viral capsids. J. Nanosci. Nanotechnol. 5, 2029-2033 (2005).
- Fowler, C. E., Shenton, W., Stubbs, G., Mann, S. Tobacco mosaic virus liquid crystals as templates for the interior design of silica mesophases and nanoparticles. Advanced Materials. 13, 1266-1269 (2001).
- Gazit, E. Use of biomolecular templates for the fabrication of metal nanowires. FEBS. J. 274, 317-322 (2007).
- Gillitzer, E., Wilts, D., Young, M., Douglas, T. Chemical modification of a viral cage for multivalent presentation. Chem. Commun. , 2390-2391 (2002).
- Hammond, R. W., Hammond, J. Maize rayado fino virus capsid proteins assemble into virus-like particles in Escherichia coli. Virus Res. 147, 208-215 (2010).
- Hermamson, G. T. . Bioconjugate techniques. , (1991).
- Kaiser, C. R., Flenniken, M. L., Gillitzer, E., Harmsen, A. L., Harmsen, A. G., Jutila, M. A., Douglas, T., Young, M. J. Biodistribution studies of protein cage nanoparticles demonstrate broad tissue distribution and rapid clearance in vivo. Int. J. Nanomed. 2, 715-733 (2007).
- Knez, M., Bittner, A. M., Boes, F., Wege, C., Jeske, H., Maisse, E., Kern, K. Biotemplate synthesis of 3-nm nickel and cobalt nanowires. Nano Lett. 3, 1079-1082 (2003).
- Lee, S. Y., Culver, J. N., Harris, M. T. Effect of CuCl2 concentration on the aggregation and mineralization of Tobacco mosaic virus biotemplate. J. Colloid. Interface. Sci. 297, 554-560 (2006).
- Lvov, Y., Haas, H., Decher, G., Mohwald, H., Mikhailov, A., Mtchedlishvily, B., Morgunova, E., Vainshtein, B. Successive deposition of alternate layers of polyelectrolytes and a charged virus. Langmuir. 10, 4232-4236 (1994).
- Natilla, A., Hammond, R. W. Maize rayado fino virus virus-like particles expressed in tobacco plants: a new platform for cysteine selective bioconjugation peptide display. J. Virol. Methods. 178, 209-215 (2011).
- Rae, C. S., Khor, I. W., Wang, Q., Destito, G., Gonzalez, M. J., Singh, P., Thomas, D. M., Estrada, M. N., Powell, E., Finn, M. G., Manchester, M. Systemic trafficking of plant virus nanoparticles in mice via the oral route. Virology. 343, 2224-2235 (2005).
- Raja, K. S., Wang, Q., Gonzalez, M. J., Manchester, M., Johnson, J. E., Finn, M. G. Hybrid virus-polymer materials. Synthesis and properties of PEG-decorated Cowpea mosaic virus. Biomacromolecules. 4, 472-476 (2003).
- Royston, E., Lee, S. Y., Culver, J. N., Harris, M. T. Characterization of silica-coated Tobacco mosaic virus. J. Colloid Interface Sci. 298, 706-712 (2006).
- Schlick, T. L., Ding, Z., Kovacs, E. W., Francis, M. B. Dual-surface modification in the Tobacco mosaic virus. J. Am. Chem. Soc. 127, 3718-3723 (2005).
- Young, M., Willits, D., Uchida, M., Douglas, T. Plant viruses as biotemplates for materials and their use in nanotechnology. Annu. Rev. Phytopathol. 46, 361-384 (2008).
