ניתוח של הנגישות המרככת של שאריות ציסטאין על<em&gt; תירס rayado Fino וירוס</em&gt; חלקיקי נגיף דמויים מיוצרים ב<em&gt; Nicotiana benthamiana</em&gt; צמחים וקישור צולב של פפטידים לVLPs

סיכום

שיטה לנתח את נגישות הממס של קבוצת thiol של שאריות ציסטאין של תירס rayado Fino וירוס (MRFV) חלקיקי וירוס דמוי (VLPs) ואחריו תגובה של פפטיד צלב-linking מתוארים. השיטה מנצלת את הזמינות של מספר קבוצות כימיות על פני השטח של VLPs שיכול להיות מטרה לתגובות ספציפיות.

תקציר

חיקוי וניצול מאפייני נגיף ומאפייני physicochemical ופיסיים טומן בחובו הבטחה לספק פתרונות לכמה מהאתגרים הקשים ביותר בעולם. המגוון והסוגים של וירוסים יחד עם המאפיינים המסקרנים הצרופים פוטנציאלי לתת אינספור הזדמנויות ליישומים בטכנולוגיות וירוס מבוססים. וירוסים יש את היכולת עצמית להרכיב לתוך חלקיקים בעלי צורה דיסקרטית וגודל, סגולי של סימטריה, polyvalence, ומאפיינים יציבים תחת מגוון רחב של תנאי טמפרטורה וחומציות. שלא במפתיע, עם מגוון עשיר כל כך של תכונות, וירוסים מוצעים לשימוש בחומרים ביולוגיים ^9, חיסונים ^{14, 15,} חומרים אלקטרוניים, כלים כימיים, ^ו11 מיכלים מולקולריים אלקטרוניים ^{4, 5, 10, 16, 18, ​​12.}

על מנת לנצל וירוסים בננוטכנולוגיה, הם חייבים להיות שונים מהצורות הטבעיות שלהם כדי להקנות פונקציות חדשות. זה יחסי ציבור מאתגריםocess יכול להתבצע באמצעות מספר מנגנונים כולל הנדסה גנטית של הגנום הנגיפי וכימיות הצמדת מולקולות זרות או רצויות לקבוצות תגובתי חלקיקי וירוס ^8. היכולת לשנות וירוס בעיקר תלויה במאפייני physiochemical ופיסיים של הנגיף. בנוסף, שינויים הגנטיים או physiochemical צריכות להתבצע מבלי להשפיע על המבנה ותפקוד יליד וירוס וירוס לרעה. (MRFV) חלבוני מעייל rayado תירס Fino וירוס עצמי להרכיב בחיידקי Escherichia ייצור VLPs היציב וריק שהם התייצבו על ידי בין חלבונים אינטראקציות ושניתן להשתמש ביישומים מבוססי טכנולוגיות וירוס ^8. VLPs מיוצר בצמחי טבק נבדק כפיגום עליו מגוון של פפטידים ניתן להציג ¹³ קוולנטית. כאן, אנו מתארים את השלבים ל1) תקבעו מי מcysteines ממס הנגיש בcapsid וירוס זמין לmodifiקטיון, ו2) Bioconjugate פפטידים לcapsids השונה. באמצעות שאריות דובר או mutationally הוכנסו-חומצת אמינו וטכנולוגיות צימוד סטנדרטיות, במגוון רחב של חומרים שמוצגים על פני השטח של וירוסי צמחים כגון, וירוס Brome פסיפס ^3, וירוס mottle ציפורנים ^12, Cowpea chlorotic mottle ⁶ וירוס, פסיפס טבק וירוס ^17, וירוס לפת צהוב פסיפס ^1, וMRFV ^13.

פרוטוקול

1. הרכבת חיסון נגיף וטיהור VLPs מצמחי Nicotiana benthamiana

1. לייצר תעתיקי תרי T7-RNA מתפו"א וירוס X (PVX)-מבוססי פלסמידים וקטור שנשאו MRFV חלבון Cys מוטצית מעייל (CP) גנים ^12, באמצעותו של Ambion T7-mMessage mMachine הקיט פראי מסוג (wt) ו.
2. לכל תגובת תמליל T7, לחסן שני עלים התרחבו באופן מלא של נ benthamiana עם 10 תגובות μl ולדגור על הצמחים במשך 10 ימים בחממה, בתנאי לחות 60% עבור 16 שעות עם אור (25,000-30,000 לוקס) בשעת 25 ° C ו 8 שעתי חשכה בשעת 20 ° C.

תוצאות

ביטוי זמני של גני חלבוני מוטצית MRFV מעייל (CP) בנ צמחי benthamiana בVLPs ייצור הווקטור PVX מבוסס מתוארים באיור 1. גן חלבון מעייל MRFV modified מוגבר באמצעות PCR ולאחר מכן תחת שליטת התעתיק של אמרגן CP subgenomic המשוכפל בוקטור PVX מבוסס, pP2C2S ^2, (מתנה של ד Baulcombe, מעבדות סיינסבורי, נוריץ', אנגליה). ב תעתיק הרנ"א מבחנה מייצר תעתיקי רנ"א אז המשמשים לחסן נ צמחי benthamiana. בצמחים הנג.......

דיון

השיטה שהוצגה כאן מאפשרת ניתוח מאוד רגיש ומהיר של cysteines הווה על פני השטח של VLPs בצמחים המיוצרים כמו גם במערכות חלבון אחרות תגובתי. Maleimides הם ריאגנטים thiol ספציפיים, אשר מגיבים עם מולקולות חופשיות sulfhydryl המכילים ליצור קשרי thioether יציבים. שיטה זו נשענת על הספציפיות של maleimides להגיב עם קבוצות sulfhydryl אינה מעורבת באינטראקציות עם חומצות אמינו אחרות. שימור המבנה המקורי של VLPs חשוב מאוד בכל התהליך. ביישום המתואר, התגובות מבוצעות בתנאים מקומיים וב pH 7 כדי לשמור על .......

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שם המגיב	חברה	מספר קטלוגים	תגובות
Thinwall, צינורות-Ultra Clear	Beckman	344059
mMESSAGE mMACHINE T7 קיט	Tecnologies חיים	AM1344M
Fluorescein-5-Maleimide	חי טכנולוגיות מדעיות Thermo	46130 F150	46130 הם מתחליף סדר עם F150
ערכת quantitation ביוטין פירס	Thermo Scientific	28005
EZ-קישור Maleimide-PEG2-ביוטין, אף לשקול פורמט	Thermo Scientific	21901
SM n Crosslinkers (PEG)	Thermo Scientific	22107
10-20% טריס-גליצין ג'ל	Invitrogen	EC61352
Laemmli המאגר	Bio-Rad	1610737
טריס גליצין SDS ריצת המאגר	Invitrogen	LC2675
טריס גליצין העברת המאגר	Invitrogen	LC3675
כריך נייר מסנן ממברנה ניטרוצלולוזה	Invitrogen	LC2001
זיקת שכותרת phosphatase מטוהרי נוגדני IgG לארנב	Kirkegaard ומעבדות פרי	0751516
תשתית phosphatase NBT / BCIP	Kirkegaard ומעבדות פרי	508107