Analyse av oppløsningsmidlet Tilgjengelighet av cysteinrester på<em> Mais rayado fino virus</em> Viruslignende partikler produsert i<em> Nicotiana benthamiana</em> Planter og Cross-linking av peptider til VLP
Summary
En metode for å analysere løsningsmidlet tilgjengeligheten av tiolgruppe av cysteinrester av<em> Mais rayado fino virus</em> (MRFV)-viruslignende partikler (VLP) etterfulgt av en peptid kryssbinding reaksjonen er beskrevet. Metoden utnytter tilgjengeligheten av flere kjemiske grupper på overflaten av VLP som kan være mål for bestemte reaksjoner.
Abstract
Etterligne og utnytte virus egenskaper og fysisk-kjemiske og fysiske egenskaper holder løftet å tilby løsninger til noen av verdens mest presserende utfordringer. Selve området og typer virus kombinert med deres spennende egenskaper potensielt gi uendelige muligheter for applikasjoner i virus-baserte teknologier. Virus har evnen til selv montere inn partikler med diskrete form og størrelse, spesifisitet symmetri, polyvalence og stabile egenskaper under et bredt temperaturområde og pH-betingelser. Ikke overraskende, med en slik bemerkelsesverdig spekter av egenskaper, er virus foreslått for bruk i biomaterialer 9, vaksiner 14, 15, elektroniske materialer, kjemiske verktøy og molekylær elektronisk 4 containere, 5, 10, 11, 16, 18, 12.
For å utnytte virus i nanoteknologi, må de endres fra sine naturlige former for å formidle nye funksjoner. Dette utfordrende process kan utføres gjennom flere mekanismer inkludert genetisk modifisering av det virale genom og kjemisk feste utenlandske eller ønskede molekyler til viruspartikkel reaktive grupper 8. Muligheten til å endre et virus avhenger hovedsakelig på de fysiokjemiske og fysiske egenskaper av viruset. I tillegg, den genetiske eller fysiokjemiske modifikasjoner må utføres uten skadelig virkning på viruset innfødte struktur og virus funksjon. Mais rayado fino virus (MRFV) belegge proteiner selv sette sammen i Escherichia coli som produserer stabile og tom VLP som er stabilisert av protein-protein interaksjoner og som kan brukes i virus-baserte teknologier anvendelser 8. VLP produsert tobakksplanter ble undersøkt som et stillas som en rekke peptider kan kovalent vises 13. Her beskriver vi trinnene til 1) bestemmer hvilke av de løsningsmiddel-tilgjengelige cysteinene i et virus kapsid er tilgjengelig for modifikation, og 2) Bioconjugate peptider til de endrede capsids. Ved å bruke Native eller mutationally-innsatt aminosyrerester og standardforskruning teknologier har et bredt utvalg av materialer blitt vist på overflaten av plante virus såsom Brome mosaikk virus 3, Carnation mottle virus 12, Cowpea anemiske mottle virus 6, tobakk mosaikk virus 17, Turnip gul mosaikk virus 1 og 13 MRFV.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metoden presenteres her muliggjør en meget følsom og rask analyse av reaktive cysteinene tilstede på overflaten av plante-produsert VLP samt andre protein komplekser. Maleimides er thiol-spesifikke reagenser, som reagerer med frie sulfhydryl-holdige molekyler for å danne stabile tioeter obligasjoner. Denne metoden bygger på spesifisiteten av maleimides å reagere med sulfhydryl grupper som ikke er involvert i interaksjoner med andre aminosyrer. Bevaring av lokale struktur VLP er svært viktig gjennom hele prosessen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| Thinwall, Ultra-Clear Tubes | Beckman | 344059 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 Kit | Life Tecnologies | AM1344M | |
| Fluorescein-5-Maleimide | Thermo Scientific Life Technologies | 46130 F150 | 46130 is out of order substitute with F150 |
| Pierce Biotin Quantitation Kit | Thermo Scientific | 28005 | |
| EZ-Link Maleimide-PEG2-Biotin, No-Weigh Format | Thermo Scientific | 21901 | |
| SM(PEG)n Crosslinkers | Thermo Scientific | 22107 | |
| 10-20% Tris-Glycine gel | Invitrogen | EC61352 | |
| Laemmli Buffer | Bio-Rad | 1610737 | |
| Tris Glycine SDS Running Buffer | Invitrogen | LC2675 | |
| Tris Glycine Transfer Buffer | Invitrogen | LC3675 | |
| Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich | Invitrogen | LC2001 | |
| Phosphatase Labeled Affinity Purified Antibody to Rabbit IgG | Kirkegaard and Perry Laboratories | 0751516 | |
| NBT/BCIP Phosphatase Substrate | Kirkegaard and Perry Laboratories | 508107 |
References
- Barnhill, H., Reuther, R., Ferguson, P. L., Dreher, T. W., Wang, Q. Turnip yellow mosaic virus as a chemoaddressable bionanoparticle. Bioconj. Chem. 18, 852-859 (2007).
- Chapman, S., Kavanagh, T., Baulcombe, D. Potato virus X as a vector for gene expression in plants. Plant J. 2, 549-557 (1992).
- Chen, C., Kwak, E. S., Stein, B., Kao, C. C., Dragnea, B. Packaging of gold particles in viral capsids. J. Nanosci. Nanotechnol. 5, 2029-2033 (2005).
- Fowler, C. E., Shenton, W., Stubbs, G., Mann, S. Tobacco mosaic virus liquid crystals as templates for the interior design of silica mesophases and nanoparticles. Advanced Materials. 13, 1266-1269 (2001).
- Gazit, E. Use of biomolecular templates for the fabrication of metal nanowires. FEBS. J. 274, 317-322 (2007).
- Gillitzer, E., Wilts, D., Young, M., Douglas, T. Chemical modification of a viral cage for multivalent presentation. Chem. Commun. , 2390-2391 (2002).
- Hammond, R. W., Hammond, J. Maize rayado fino virus capsid proteins assemble into virus-like particles in Escherichia coli. Virus Res. 147, 208-215 (2010).
- Hermamson, G. T. . Bioconjugate techniques. , (1991).
- Kaiser, C. R., Flenniken, M. L., Gillitzer, E., Harmsen, A. L., Harmsen, A. G., Jutila, M. A., Douglas, T., Young, M. J. Biodistribution studies of protein cage nanoparticles demonstrate broad tissue distribution and rapid clearance in vivo. Int. J. Nanomed. 2, 715-733 (2007).
- Knez, M., Bittner, A. M., Boes, F., Wege, C., Jeske, H., Maisse, E., Kern, K. Biotemplate synthesis of 3-nm nickel and cobalt nanowires. Nano Lett. 3, 1079-1082 (2003).
- Lee, S. Y., Culver, J. N., Harris, M. T. Effect of CuCl2 concentration on the aggregation and mineralization of Tobacco mosaic virus biotemplate. J. Colloid. Interface. Sci. 297, 554-560 (2006).
- Lvov, Y., Haas, H., Decher, G., Mohwald, H., Mikhailov, A., Mtchedlishvily, B., Morgunova, E., Vainshtein, B. Successive deposition of alternate layers of polyelectrolytes and a charged virus. Langmuir. 10, 4232-4236 (1994).
- Natilla, A., Hammond, R. W. Maize rayado fino virus virus-like particles expressed in tobacco plants: a new platform for cysteine selective bioconjugation peptide display. J. Virol. Methods. 178, 209-215 (2011).
- Rae, C. S., Khor, I. W., Wang, Q., Destito, G., Gonzalez, M. J., Singh, P., Thomas, D. M., Estrada, M. N., Powell, E., Finn, M. G., Manchester, M. Systemic trafficking of plant virus nanoparticles in mice via the oral route. Virology. 343, 2224-2235 (2005).
- Raja, K. S., Wang, Q., Gonzalez, M. J., Manchester, M., Johnson, J. E., Finn, M. G. Hybrid virus-polymer materials. Synthesis and properties of PEG-decorated Cowpea mosaic virus. Biomacromolecules. 4, 472-476 (2003).
- Royston, E., Lee, S. Y., Culver, J. N., Harris, M. T. Characterization of silica-coated Tobacco mosaic virus. J. Colloid Interface Sci. 298, 706-712 (2006).
- Schlick, T. L., Ding, Z., Kovacs, E. W., Francis, M. B. Dual-surface modification in the Tobacco mosaic virus. J. Am. Chem. Soc. 127, 3718-3723 (2005).
- Young, M., Willits, D., Uchida, M., Douglas, T. Plant viruses as biotemplates for materials and their use in nanotechnology. Annu. Rev. Phytopathol. 46, 361-384 (2008).
