Analys av lösningsmedel tillgänglighet av cysteinrester på<em> Majs rayado fino-virus</em> Virusliknande partiklar framställda i<em> Nicotiana benthamiana</em> Växter och tvärbindning av peptider till VLP
Summary
En metod för att analysera lösningsmedlet tillgängligheten av tiolgruppen av cysteinrester i<em> Majs rayado fino-virus</em> (MRFV)-virusliknande partiklar (VLP) följt av en peptid tvärbindningsreaktion beskrives. Metoden drar fördel av tillgängligheten av flera kemiska grupper på ytan av VLP som kan vara mål för specifika reaktioner.
Abstract
Efterlikna och utnyttja virus egenskaper och fysikalisk-kemiska och fysiska egenskaper har förutsättningar att tillhandahålla lösningar till några av världens mest akuta utmaningar. Det stora sortimentet och typer av virus i kombination med deras spännande egenskaper ger potentiellt oändliga möjligheter för applikationer i virus-baserade tekniker. Virus har förmågan att själv montera in partiklar med diskret form och storlek, specificitet symmetri, mångsidighet och stabila egenskaper under en lång rad av temperatur-och pH-förhållanden. Inte överraskande, med en sådan anmärkningsvärd uppsättning egenskaper är virus föreslagits för användning i biomaterial 9, 14 vacciner, 15, elektroniska material, verktyg kemiska och molekylär elektronisk behållare 4, 5, 10, 11, 16, 18, 12.
För att utnyttja virus i nanoteknik, måste de ändras från sina naturliga former för att ge nya funktioner. Denna utmanande process kan utföras genom flera mekanismer, inklusive genetisk modifiering av det virala genomet och kemiskt fästa utländska eller önskad molekyler till de reaktiva viruspartikel grupperna 8. Förmågan att modifiera ett virus beror primärt på de fysiokemiska och fysikaliska egenskaper hos viruset. Dessutom genetiska eller fysiokemiska ändringar behöver göras utan att negativt påverka viruset nativa struktur och virus funktion. Majs rayado fino virus (MRFV) höljeproteiner själv montera i Escherichia coli som producerar stabila och tomma VLP som stabiliseras genom protein-protein interaktioner och som kan användas i virus-baserade tekniker applikationer 8. VLP som produceras i tobaksplantor undersöktes som en klätterställning som olika peptider kan kovalent visas 13. Här beskriver vi stegen att 1) bestämma vilka av de lösningsmedel-åtkomliga cysteiner i ett virus kapsid är tillgängliga för modifikatjon, och 2) biokonjugatet peptider till de modifierade kapsider. Genom att använda naturliga eller mutationellt-in aminosyrarester och standardkoppling teknik, har en mängd olika material visats på ytan av växtvirus såsom Brome viruset 3, Nejlika mottle virus 12, Cowpea klorotiska mottle virus 6, tobak mosaik virus 17, kålrot gul viruset 1 och MRFV 13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metoden presenteras här ger en mycket känslig och snabb analys av reaktiva cysteiner som finns på ytan av anläggningen producerade VLP samt andra proteinkomplex. Maleimider är tiol-specifika reagens, som reagerar med fria sulfhydryl-innehållande molekyler för att bilda stabila tioeterbindningar. Denna metod bygger på specificitet maleimiderna att reagera med sulfhydrylgrupperna inte deltar i interaktioner med andra aminosyror. Bevara den nativa strukturen hos VLP är mycket viktigt genom hela processen. I den be…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| Thinwall, Ultra-Clear Tubes | Beckman | 344059 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 Kit | Life Tecnologies | AM1344M | |
| Fluorescein-5-Maleimide | Thermo Scientific Life Technologies | 46130 F150 | 46130 is out of order substitute with F150 |
| Pierce Biotin Quantitation Kit | Thermo Scientific | 28005 | |
| EZ-Link Maleimide-PEG2-Biotin, No-Weigh Format | Thermo Scientific | 21901 | |
| SM(PEG)n Crosslinkers | Thermo Scientific | 22107 | |
| 10-20% Tris-Glycine gel | Invitrogen | EC61352 | |
| Laemmli Buffer | Bio-Rad | 1610737 | |
| Tris Glycine SDS Running Buffer | Invitrogen | LC2675 | |
| Tris Glycine Transfer Buffer | Invitrogen | LC3675 | |
| Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich | Invitrogen | LC2001 | |
| Phosphatase Labeled Affinity Purified Antibody to Rabbit IgG | Kirkegaard and Perry Laboratories | 0751516 | |
| NBT/BCIP Phosphatase Substrate | Kirkegaard and Perry Laboratories | 508107 |
References
- Barnhill, H., Reuther, R., Ferguson, P. L., Dreher, T. W., Wang, Q. Turnip yellow mosaic virus as a chemoaddressable bionanoparticle. Bioconj. Chem. 18, 852-859 (2007).
- Chapman, S., Kavanagh, T., Baulcombe, D. Potato virus X as a vector for gene expression in plants. Plant J. 2, 549-557 (1992).
- Chen, C., Kwak, E. S., Stein, B., Kao, C. C., Dragnea, B. Packaging of gold particles in viral capsids. J. Nanosci. Nanotechnol. 5, 2029-2033 (2005).
- Fowler, C. E., Shenton, W., Stubbs, G., Mann, S. Tobacco mosaic virus liquid crystals as templates for the interior design of silica mesophases and nanoparticles. Advanced Materials. 13, 1266-1269 (2001).
- Gazit, E. Use of biomolecular templates for the fabrication of metal nanowires. FEBS. J. 274, 317-322 (2007).
- Gillitzer, E., Wilts, D., Young, M., Douglas, T. Chemical modification of a viral cage for multivalent presentation. Chem. Commun. , 2390-2391 (2002).
- Hammond, R. W., Hammond, J. Maize rayado fino virus capsid proteins assemble into virus-like particles in Escherichia coli. Virus Res. 147, 208-215 (2010).
- Hermamson, G. T. . Bioconjugate techniques. , (1991).
- Kaiser, C. R., Flenniken, M. L., Gillitzer, E., Harmsen, A. L., Harmsen, A. G., Jutila, M. A., Douglas, T., Young, M. J. Biodistribution studies of protein cage nanoparticles demonstrate broad tissue distribution and rapid clearance in vivo. Int. J. Nanomed. 2, 715-733 (2007).
- Knez, M., Bittner, A. M., Boes, F., Wege, C., Jeske, H., Maisse, E., Kern, K. Biotemplate synthesis of 3-nm nickel and cobalt nanowires. Nano Lett. 3, 1079-1082 (2003).
- Lee, S. Y., Culver, J. N., Harris, M. T. Effect of CuCl2 concentration on the aggregation and mineralization of Tobacco mosaic virus biotemplate. J. Colloid. Interface. Sci. 297, 554-560 (2006).
- Lvov, Y., Haas, H., Decher, G., Mohwald, H., Mikhailov, A., Mtchedlishvily, B., Morgunova, E., Vainshtein, B. Successive deposition of alternate layers of polyelectrolytes and a charged virus. Langmuir. 10, 4232-4236 (1994).
- Natilla, A., Hammond, R. W. Maize rayado fino virus virus-like particles expressed in tobacco plants: a new platform for cysteine selective bioconjugation peptide display. J. Virol. Methods. 178, 209-215 (2011).
- Rae, C. S., Khor, I. W., Wang, Q., Destito, G., Gonzalez, M. J., Singh, P., Thomas, D. M., Estrada, M. N., Powell, E., Finn, M. G., Manchester, M. Systemic trafficking of plant virus nanoparticles in mice via the oral route. Virology. 343, 2224-2235 (2005).
- Raja, K. S., Wang, Q., Gonzalez, M. J., Manchester, M., Johnson, J. E., Finn, M. G. Hybrid virus-polymer materials. Synthesis and properties of PEG-decorated Cowpea mosaic virus. Biomacromolecules. 4, 472-476 (2003).
- Royston, E., Lee, S. Y., Culver, J. N., Harris, M. T. Characterization of silica-coated Tobacco mosaic virus. J. Colloid Interface Sci. 298, 706-712 (2006).
- Schlick, T. L., Ding, Z., Kovacs, E. W., Francis, M. B. Dual-surface modification in the Tobacco mosaic virus. J. Am. Chem. Soc. 127, 3718-3723 (2005).
- Young, M., Willits, D., Uchida, M., Douglas, T. Plant viruses as biotemplates for materials and their use in nanotechnology. Annu. Rev. Phytopathol. 46, 361-384 (2008).
