테트라싸이클린-inducible (Tet-에서) shRNA 또는 cDNA 표현과 안정적인 인간 세포 라인의 생성
Summary
inducible과 관심의 유전자의 치료 cDNA overexpression 또는 shRNA로 인한 똑 다운과 인간의 세포 라인을 생성하기 위해 신속하고 간단한 방법. 이 방법은 일시적 transfection 방법 또는 기존 최저 / 한방 전략에 의해 변경하기가 어렵 안정적으로 높은 reproducibly 조작 세포 라인에 연구자 수 있습니다.
Abstract
포유류의 세포 생물학 분야의 주요 접근 방식은 공개 할 목적으로, 선택한 셀 라인에 대한 관심의 유전자의 표현의 조작이 하나 이상의 유전자의 과도 / 안정 overexpression 또는 분해를 사용하여 유전자의 기능 (들)의 여러 관심. 불행하게도, 다양한 세포 생물 조사에 대해이 방법은 적합 할 때 세포의 성장 / 확산 결함이나 원치 않는 세포 분화의 유전자 발현 결과의 조작. 따라서, 연구자들은 E.에서 가져온 테트라싸이클린 억제 단백질을 (TetR), 적응 대장균의 테트라 사이클린 내성 오페론 1,2,3 포유류의 세포에 cDNAs을 표현하는 매우 효율적이고 긴밀한 규제 시스템을 생성합니다. 즉, TetR은의 TO에 테트라 사이클린 (Tet – 오프 시스템이라고한다)의 추가시 발기인 지역의 Tet-연산자 (TO)에 바인딩 또는 (2) 바인드에 의해 전사 (1) 블록 개시 하나에 수정되었습니다 티테트라 사이클린의 그 부재 (시스템 Tet 기능이라고한다) (그림 1). Tet – 오프 시스템은 테트라 사이클린의 지속적인 존재를 (이는 조직 세포 배양 매체에 약 24 시간의 반감기가) 필요하다는 불편을 끼쳐 드려 감안할 때 Tet는 -에서 시스템보다 폭이 매우 촉박 개발의 결과, 최적화 된 및 cDNA 표현 효율적인 벡터 시스템은 여기에 사용 된.
바로 짧은 머리 핀의 자형 RNAs (shRNAs)를 표현하는 4 포유류 세포 벡터에서 유전자 최저에 대한 RNA 간섭 (RNAi)의 설립 이후 siRNAs 5-11와 매우 유사한이 기능은 설명했다. 유전자 타겟 세포 생존을 위해 필수적입니다 때 안정적으로 고갈이 적합하지 않을 때문에 그러나, 이러한 shRNA로 인한 최저의 접근 방법은 기존의 한방 전략과 같은 제한이 있습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 밴 드 Wetering 외. 12 shRNA 표현 벡터 pSUPER에게 수정 5 </su그들에게 관심의 대상 유전자의 테트라 사이클린-inducible 고갈과 안정적인 셀 행을 생성 할 수있게 발기인 지역에에를 삽입하여 P를>.
여기, 우리는 효율적으로 생성하는 방법을 설명 안정된 인간 Tet-inducible에 안정적으로의 overexpression 또는 관심의 유전자의 고갈 중 하나를 운전 세포 라인. 이 방법 사용, 우리는 성공적으로 생성했습니다 Tet-에 크게 중심체 13,14과 15,16 신호를 apoptosis에 산악 표준시 / hMOB / NDR 폭포의 분석을 촉진 세포 라인. 이 보고서에서 우리는 선택의 우리의 벡터를 설명 효율적으로 생성하는 데 필요한 두 개의 연속 조작 단계를 설명뿐만 아니라 인간의 Tet-에 세포 라인 (그림 2). 또한,의 생성을위한 프로토콜을 요약 외에 인간의 Tet-에 세포 라인, 우리는 중요한 기술적 절차에 관한 부분 및 특성화 세포 Tet 기능을 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 Tet-에 시스템이 크게 특히 조작 유전자가 세포 생존에 필수적인 경우 조작 및 / 또는하기가 어렵 전지 시스템에서 유전자 기능의 분석을 용이하게 있다고 생각합니다. 또한, 매우 구체적인 Tet-에 시스템에 의해 유전자 발현을 제어 할 수있는 능력은 다른 단계 (세포주기의 진행이나 잘 정의 된 차별화 프로세스 동안 예를 들어)에 유전자 기능을 연구 할 수있는 기회를 제공합니다. 여기…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 도움이 논의에 대한 우리 연구실의 모든 구성원을 감사드립니다. 우리는 원고의 중요한 읽기 안나 Lisztwan과 크리스티나 Gewinner 감사드립니다. 이 작품은 BBSRC 기금 BB/I021248/1 지원하고 웰컴 트러스트 부여 090090/Z/09/ZAH은 UCL 암 연구소에서 웰컴 트러스트 연구 경력 개발 동료가되었습니다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Fetal Bovine Serum(FBS) | Invitrogen | 16000-044 | Tested Tet-free |
| Blasticidin | Invivogen | ant-bl-1 | |
| Zeocin | Invivogen | ant-zn-5 | |
| G418 | PAA laboratories | P31-011 | 100 mg/ml in media |
| anti-TET02 | MoBiTec GmbH | TET02 | Use at 1/1000 to 1/2000 for WB |
| pcDNA6/TR | Invitrogen | V1025-20 | |
| pT-Rex DEST30 | Invitrogen | 12301-016 | |
| Tetracycline | Sigma | 87128 | 2 mg/ml in ethanol |
| Doxycycline | Sigma | D9891 | 2 mg/ml in water |
| Cloning cylinders | Bellco Glass Inc. | 2090-00808 | re-useable |
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