דור של שורות תאים אנושיות יציבות עם טטרציקלין-מושרה (ט ב) shRNA או ביטוי cDNA
Summary
דרך מהירה ופשוטה ליצירת שורות תאים אנושיות עם מושרה וביטוי יתר הפיך cDNA או shRNA בתיווך עקום למטה של הגן של עניין. שיטה זו מאפשרת לחוקרי שורות תאים ואמינים ביותר reproducibly מניפולציות שקשה לשנות בשיטות transfection חולפות או אסטרטגיות קונבנציונליות מציאה / נוקאאוט.
Abstract
גישה מרכזית בתחום הביולוגיה של תא יונקת היא המניפולציה של הביטוי של גנים של עניין שורות תאים נבחרות, במטרה לחשוף את אחד או כמה מתפקודו של הגן (ות) באמצעות ביטוי יתר או מציאה חולף / יציב של הגן של עניין. למרבה הצער, לחקירות ביולוגיות תאים שונות גישה זו אינה מתאימה כאשר תוצאת מניפולציות של ביטוי גנים בתאי פגמי צמיחה / שגשוג או התמיינות תאים לא רצויה. לכן, חוקרים התאימו את החלבון המדכא טטרציקלין (TetR), נלקח מE. coli התנגדות טטרציקלין 1 אופרון, לייצר מערכות ויסות יעילות מאוד וחזקות להביע cDNAs בתאי יונקי 2,3. בקיצור, TetR שונתה כדי או (1) ייזום בלוק של שעתוק באמצעות קשירה למפעיל ט (TO) באזור המקדם על תוספת של טטרציקלין (שמכונה מערכה ט הכבוי) או (2) לאגד ל לאהוא היעדר טטרציקלין (מכונה ט במערכת) (איור 1). בהתחשב באי הנוחות שהמערכה ט הפעמי דורשת נוכחות הרציפה של טטרציקלין (שבו יש זמן מחצית חיים של כ 24 שעות במדיום תרבית תאי רקמה) ט במערכת כבר מותאם באופן נרחב יותר, וכתוצאה מכך להתפתחות מאוד הדוק ומערכות וקטור יעילות לביטוי cDNA משמשות כאן.
זמן קצר לאחר הקמתה של התערבות RNA (RNAi) למציאת גנים בתאי יונקים 4, וקטורים המבטאים RNAs-מכבנה קצרה (shRNAs) תוארה שפונקציה דומה מאוד לsiRNAs 5-11. עם זאת, גישות מציאת shRNA בתיווך אלה יש להם מגבלה כאסטרטגיות נוקאאוט קונבנציונליות, שכן דלדול יציב הוא לא ריאלי כאשר מטרות גנים הן חיוניות להישרדות תאים. כדי להתגבר על מגבלה זו, ואן דה Wetering et al. שונים 12 shRNA ביטוי וקטור pSUPER 5 </su> P על ידי החדרה לאזור האמרגן, שאפשר להם להפיק שורות תאי יציבות עם דלדול טטרציקלין-מושרה של גני מטרת עניין שלהם.
כאן, אנו מתארים שיטה יעילה להפקה יציבה אדם ט בשורות תאים שיניעו מהימן או ביטוי יתר מושרה או דלדול של הגן של עניין. באמצעות שיטה זו, יש לנו נוצרו בהצלחה ט בשורות תאים אשר הקלו באופן משמעותי על הניתוח של MST / hMOB / NDR המפל בcentrosome 13,14 ואפופטוזיס איתות 15,16. בדו"ח זה, אנו מתארים הווקטורים של בחירה שלנו, בנוסף לתיאור שני שלבי המניפולציה הרצופים הנדרשים ביעילות כדי ליצור אדם ט בשורות תאים (איור 2). יתר על כן, מלבד מתאר פרוטוקול עבור הדור של אדם ט בשורות תאים, נדונו היבטים קריטיים לגבי הנהלים הטכניים והאפיון של ט בתאים.
Protocol
Representative Results
Discussion
אנו מאמינים כי ט במערכות להקל על הניתוח של תפקוד הגן באופן משמעותי, במיוחד במערכות תא שקשה לתמרן ו / או כאשר גן המניפולציות הוא חיוני להישרדות תא. יתר על כן, היכולת לשלוט על ביטוי גנים על ידי ט במערכות מאוד ספציפיות מציעה את ההזדמנות ללמוד פונקציות גנטיות בשלבים שונים (…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לכל החברים במעבדה שלנו לדיונים מועילים. אנו מודים ג'ואנה Lisztwan וכריסטינה Gewinner לקריאה ביקורתית של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי מענק BBSRC BB/I021248/1 וקרן Wellcome מענק 090090/Z/09/ZAH היא עמית קרן Wellcome מחקר פיתוח קריירה בUCL מכון הסרטן.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Fetal Bovine Serum(FBS) | Invitrogen | 16000-044 | Tested Tet-free |
| Blasticidin | Invivogen | ant-bl-1 | |
| Zeocin | Invivogen | ant-zn-5 | |
| G418 | PAA laboratories | P31-011 | 100 mg/ml in media |
| anti-TET02 | MoBiTec GmbH | TET02 | Use at 1/1000 to 1/2000 for WB |
| pcDNA6/TR | Invitrogen | V1025-20 | |
| pT-Rex DEST30 | Invitrogen | 12301-016 | |
| Tetracycline | Sigma | 87128 | 2 mg/ml in ethanol |
| Doxycycline | Sigma | D9891 | 2 mg/ml in water |
| Cloning cylinders | Bellco Glass Inc. | 2090-00808 | re-useable |
References
- Postle, K., Nguyen, T. T., Bertrand, K. P. Nucleotide sequence of the repressor gene of the TN10 tetracycline resistance determinant. Nucleic Acids Res. 12, 4849-4863 (1984).
- Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 5547-5551 (1992).
- Gossen, M., et al. Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science. 268, 1766-1769 (1995).
- Elbashir, S. M., et al. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 411, 494-498 (2001).
- Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science. 296, 550-553 (2002).
- McManus, M. T., Petersen, C. P., Haines, B. B., Chen, J., Sharp, P. A. Gene silencing using micro-RNA designed hairpins. RNA. 8, 842-850 (2002).
- Miyagishi, M., Taira, K. U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3′ overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells. Nat. Biotechnol. 20, 497-500 (2002).
- Paddison, P. J., Caudy, A. A., Bernstein, E., Hannon, G. J., Conklin, D. S. Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells. Genes Dev. 16, 948-958 (2002).
- Paul, C. P., Good, P. D., Winer, I., Engelke, D. R. Effective expression of small interfering RNA in human cells. Nat. Biotechnol. 20, 505-508 (2002).
- Sui, G., et al. A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5515-5520 (2002).
- Yu, J. Y., DeRuiter, S. L., Turner, D. L. RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 6047-6052 (2002).
- van de Wetering, M., et al. Specific inhibition of gene expression using a stably integrated, inducible small-interfering-RNA vector. EMBO Rep. 4, 609-615 (2003).
- Hergovich, A., et al. The MST1 and hMOB1 tumor suppressors control human centrosome duplication by regulating NDR kinase phosphorylation. Curr. Biol. 19, 1692-1702 (2009).
- Hergovich, A., Lamla, S., Nigg, E. A., Hemmings, B. A. Centrosome-associated NDR kinase regulates centrosome duplication. Mol. Cell. 25, 625-634 (2007).
- Kohler, R. S., Schmitz, D., Cornils, H., Hemmings, B. A., Hergovich, A. Differential NDR/LATS interactions with the human MOB family reveal a negative role for human MOB2 in the regulation of human NDR kinases. Mol. Cell Biol. 30, 4507-4520 (2010).
- Vichalkovski, A., et al. NDR kinase is activated by RASSF1A/MST1 in response to Fas receptor stimulation and promotes apoptosis. Curr. Biol. 18, 1889-1895 (2008).
- Pear, W. S., et al. Efficient and rapid induction of a chronic myelogenous leukemia-like myeloproliferative disease in mice receiving P210 bcr/abl-transduced bone marrow. Blood. 92, 3780-3792 (1998).
