Genereren van stabiele humane cellijnen met tetracycline induceerbare (Tet-on) shRNA of cDNA Expression
Summary
Een snelle en eenvoudige manier om humane cellijnen met induceerbare en omkeerbare cDNA overexpressie of shRNA-gemedieerde knock-down van het gen van belang genereren. Deze methode kunnen onderzoekers betrouwbaar en zeer reproduceerbaar manipuleren cellijnen die moeilijk te veranderen door transiënte transfectie methoden of conventionele knockdown / knockout strategieën.
Abstract
Een belangrijke benadering op het gebied van zoogdiercel biologie is de manipulatie van de expressie van genen van belang in geselecteerde cellijnen, teneinde te onthullen een of meer van de functie van het gen (s) met behulp van transiënte / stabiele overexpressie of knockdown van het gen van belang. Helaas, voor diverse celbiologische onderzoeken deze aanpak is niet geschikt wanneer manipulaties van genexpressie resultaat in cel groei / proliferatie gebreken of ongewenste celdifferentiatie. Daarom hebben onderzoekers aangepast de tetracycline repressor eiwit (TetR), uit de E. coli tetracycline resistentie operon 1, om zeer efficiënte en strakke regelgeving genereren cDNA expressie in zoogdiercellen 2,3. Kortom, TetR aangepast om ofwel (1) blok initiatie van transcriptie door binding aan het Tet-operator (TO) in de promoter regio na toevoeging van tetracycline (Tet-off genoemd systeem) of (2) binden aan de TO thij afwezigheid van tetracycline (Tet-on genoemd systeem) (figuur 1). Aangezien het ongemak dat het Tet-off systeem de continue aanwezigheid van tetracycline (met een halfwaardetijd van ongeveer 24 uur in weefselkweek celkweekmedium) moeten Tet-on systeem is uitgebreider geoptimaliseerd, zodat de ontwikkeling van zeer strakke en efficiënte vectorsystemen voor cDNA expressie zoals hier gebruikt.
Kort na de instelling van RNA interferentie (RNAi) voor gen knockdown in zoogdiercellen 4, vectoren die korte haarspeld RNA (shRNAs) beschreven die functie, vergelijkbaar met siRNA 5-11. Echter, deze shRNA gemedieerde knockdown benaderingen hebben dezelfde beperking als conventionele knockout strategieën, aangezien stabiel uitputting niet uitvoerbaar is targets gen zijn essentieel voor cellulaire overleving. Om deze beperking te overwinnen, van de Wetering et al. 12. Wijzigde de shRNA expressievector pSUPER 5 </sup> door toevoeging van een TO in het promoter gebied, waardoor ze om stabiele cellijnen met tetracycline-induceerbare uitputting van hun doelgenen van belang genereren.
Hier beschrijven we een methode om efficiënt genereren stabiele humaan Tet-on cellijnen die betrouwbaar rijden of induceerbare overexpressie of uitputting van het gen van belang. Met deze methode, hebben we met succes gegenereerd Tet-on cellijnen die significant de analyse van de MST / hMOB / NDR cascade vergemakkelijkt centrosoom 13,14 en 15,16 signalering van apoptose. In dit rapport beschrijven we onze vectoren van keuze naast beschrijven twee opeenvolgende stappen van manipulatie die noodzakelijk zijn om efficiënt genereren menselijke Tet-on cellijnen (figuur 2). Bovendien naast waarin een protocol voor het genereren van menselijke Tet-on cellijnen bespreken we kritische aspecten van de technische procedures en karakterisering van Tet-on cellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wij geloven dat Tet-on systemen sterk de analyse van genfunctie maken, met name in celsystemen die moeilijk te manipuleren en / of wanneer de gemanipuleerde gen essentieel voor celoverleving. Bovendien de mogelijkheid om genexpressie te controleren door zeer specifieke Tet-on systemen biedt de mogelijkheid om genfuncties studeren verschillende fasen (bijvoorbeeld tijdens de celcyclus of goed gedefinieerde differentiatie). Werkwijze hier gepresenteerde onderzoekers in staat om de gewenste stabiele genereren Tet-on cellij…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken alle leden van ons laboratorium voor nuttige discussies. Wij danken Joanna Lisztwan en Christina Gewinner voor kritisch lezen van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door de BBSRC subsidie BB/I021248/1 en de Wellcome Trust subsidie 090090/Z/09/ZAH is een Wellcome Trust Research Career Development fellow aan de UCL Kanker Instituut.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Fetal Bovine Serum(FBS) | Invitrogen | 16000-044 | Tested Tet-free |
| Blasticidin | Invivogen | ant-bl-1 | |
| Zeocin | Invivogen | ant-zn-5 | |
| G418 | PAA laboratories | P31-011 | 100 mg/ml in media |
| anti-TET02 | MoBiTec GmbH | TET02 | Use at 1/1000 to 1/2000 for WB |
| pcDNA6/TR | Invitrogen | V1025-20 | |
| pT-Rex DEST30 | Invitrogen | 12301-016 | |
| Tetracycline | Sigma | 87128 | 2 mg/ml in ethanol |
| Doxycycline | Sigma | D9891 | 2 mg/ml in water |
| Cloning cylinders | Bellco Glass Inc. | 2090-00808 | re-useable |
References
- Postle, K., Nguyen, T. T., Bertrand, K. P. Nucleotide sequence of the repressor gene of the TN10 tetracycline resistance determinant. Nucleic Acids Res. 12, 4849-4863 (1984).
- Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 5547-5551 (1992).
- Gossen, M., et al. Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science. 268, 1766-1769 (1995).
- Elbashir, S. M., et al. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 411, 494-498 (2001).
- Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science. 296, 550-553 (2002).
- McManus, M. T., Petersen, C. P., Haines, B. B., Chen, J., Sharp, P. A. Gene silencing using micro-RNA designed hairpins. RNA. 8, 842-850 (2002).
- Miyagishi, M., Taira, K. U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3′ overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells. Nat. Biotechnol. 20, 497-500 (2002).
- Paddison, P. J., Caudy, A. A., Bernstein, E., Hannon, G. J., Conklin, D. S. Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells. Genes Dev. 16, 948-958 (2002).
- Paul, C. P., Good, P. D., Winer, I., Engelke, D. R. Effective expression of small interfering RNA in human cells. Nat. Biotechnol. 20, 505-508 (2002).
- Sui, G., et al. A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5515-5520 (2002).
- Yu, J. Y., DeRuiter, S. L., Turner, D. L. RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 6047-6052 (2002).
- van de Wetering, M., et al. Specific inhibition of gene expression using a stably integrated, inducible small-interfering-RNA vector. EMBO Rep. 4, 609-615 (2003).
- Hergovich, A., et al. The MST1 and hMOB1 tumor suppressors control human centrosome duplication by regulating NDR kinase phosphorylation. Curr. Biol. 19, 1692-1702 (2009).
- Hergovich, A., Lamla, S., Nigg, E. A., Hemmings, B. A. Centrosome-associated NDR kinase regulates centrosome duplication. Mol. Cell. 25, 625-634 (2007).
- Kohler, R. S., Schmitz, D., Cornils, H., Hemmings, B. A., Hergovich, A. Differential NDR/LATS interactions with the human MOB family reveal a negative role for human MOB2 in the regulation of human NDR kinases. Mol. Cell Biol. 30, 4507-4520 (2010).
- Vichalkovski, A., et al. NDR kinase is activated by RASSF1A/MST1 in response to Fas receptor stimulation and promotes apoptosis. Curr. Biol. 18, 1889-1895 (2008).
- Pear, W. S., et al. Efficient and rapid induction of a chronic myelogenous leukemia-like myeloproliferative disease in mice receiving P210 bcr/abl-transduced bone marrow. Blood. 92, 3780-3792 (1998).
