Generazione di linee cellulari umane stabili con tetraciclina-inducibile (Tet-on) shRNA o espressione di cDNA
Summary
Un modo rapido e semplice per generare linee cellulari umane di inducibile e reversibile sovraespressione cDNA o shRNA-mediata knock-down del gene di interesse. Questo metodo consente ai ricercatori di linee cellulari altamente affidabile e riproducibile manipolare che sono difficili da modificare con metodi di trasfezione transiente o convenzionali atterramento / knockout strategie.
Abstract
Un approccio importante nel campo della biologia cellulare di mammifero è la manipolazione dell'espressione dei geni di interesse in linee cellulari selezionate, con lo scopo di rivelare una o più funzione del gene (s) con sovraespressione transiente / stabile o knockdown del gene di interesse. Purtroppo, per le indagini cellulari diversi biologici questo approccio non è adatto quando le manipolazioni del risultato dell'espressione genica in cellule di crescita / proliferazione difetti o differenziazione cellulare indesiderata. Pertanto, i ricercatori hanno adattato la proteina repressore tetraciclina (tetR), tratto dal E. coli resistenza alla tetraciclina operone 1, per generare sistemi di regolazione molto efficienti e stretto per esprimere cDNA in cellule di mammifero 2,3. In breve, tetR è stato modificato a uno (1) blocco di inizio trascrizione legandosi al Tet-operatore (TO) nel promotore per aggiunta di tetraciclina (Tet-off definito sistema) o (2) si legano al TO in tegli assenza di tetraciclina (Tet-definito sul sistema) (Figura 1). Data l'inconveniente che il Tet-off sistema richiede la presenza continua di tetraciclina (che ha una emivita di circa 24 ore in terreno di coltura cellulare tissutale) il Tet-il sistema è stato più ampiamente ottimizzata, con conseguente sviluppo di molto stretto ed efficienti sistemi vettore di espressione di cDNA come usato qui.
Poco dopo la creazione di RNA interference (RNAi) per atterramento gene in cellule di mammifero 4, vettori che esprimono breve hairpin RNA (shRNA) sono stati descritti che funzione molto simile a siRNA 5-11. Tuttavia, questi approcci shRNA-mediati atterramento presenta la stessa limitazione come strategie knockout convenzionali, in quanto l'esaurimento stabile non è fattibile se gli obiettivi di geni sono essenziali per la sopravvivenza cellulare. Per superare questa limitazione, van de Wetering et al 12. Modificato l'espressione shRNA vettore pSUPER 5 </su> p inserendo un TO nella regione del promotore, che ha permesso loro di generare linee cellulari stabili con tetraciclina inducibile deplezione dei loro geni bersaglio di interesse.
Qui, si descrive un metodo per generare efficientemente umana stabile Tet-on linee cellulari che guidano affidabile iperespressione inducibile o deplezione del gene di interesse. Utilizzando questo metodo, siamo riusciti generato Tet-on linee cellulari che hanno notevolmente facilitato l'analisi del MST / hMOB / NDR cascata in centrosoma 13,14 e apoptosi segnalazione 15,16. In questo rapporto, descriviamo i nostri vettori di scelta, oltre a descrivere i due passaggi consecutivi di manipolazione che sono necessari per generare efficientemente umana Tet-on linee cellulari (Figura 2). Inoltre, oltre a delineare un protocollo per la generazione di umana Tet-on linee cellulari, discuteremo aspetti critici riguardanti le procedure tecniche e la caratterizzazione di cellule Tet-on.
Protocol
Representative Results
Discussion
Crediamo che Tet-sui sistemi facilitare notevolmente l'analisi della funzione genica, in particolare in sistemi cellulari che sono difficili da manipolare e / o quando il gene manipolato è essenziale per la sopravvivenza cellulare. Inoltre, la capacità di controllare l'espressione genica altamente specifici Tet-sui sistemi offre l'opportunità di studiare funzioni geniche in diverse fasi (per esempio durante la progressione del ciclo cellulare o ben definiti processi di differenziazione). Il metodo qui pre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo tutti i membri del nostro laboratorio per le discussioni utili. Ringraziamo Joanna Lisztwan e Christina Gewinner per la lettura critica del manoscritto. Questo lavoro è stato finanziato dalla sovvenzione BBSRC BB/I021248/1 e il Wellcome Trust concessione 090090/Z/09/ZAH è un Wellcome Trust Research fellow presso il Career Development UCL Cancer Institute.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Fetal Bovine Serum(FBS) | Invitrogen | 16000-044 | Tested Tet-free |
| Blasticidin | Invivogen | ant-bl-1 | |
| Zeocin | Invivogen | ant-zn-5 | |
| G418 | PAA laboratories | P31-011 | 100 mg/ml in media |
| anti-TET02 | MoBiTec GmbH | TET02 | Use at 1/1000 to 1/2000 for WB |
| pcDNA6/TR | Invitrogen | V1025-20 | |
| pT-Rex DEST30 | Invitrogen | 12301-016 | |
| Tetracycline | Sigma | 87128 | 2 mg/ml in ethanol |
| Doxycycline | Sigma | D9891 | 2 mg/ml in water |
| Cloning cylinders | Bellco Glass Inc. | 2090-00808 | re-useable |
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