Un modelo ortotópico de cáncer de vejiga de Estudios de liberación de genes

Summary

Implantación de células de cáncer en el órgano de origen puede servir como un modelo preclínico útil para evaluar nuevas terapias. Células de carcinoma de vejiga MB49 se pueden cultivar dentro de la vejiga después de la instilación intravesical. Este protocolo demuestra la cateterización de la vejiga de ratón para el propósito de la implantación del tumor y la entrega adenoviral.

Abstract

El cáncer de vejiga es el segundo cáncer más común del tracto urogenital y nuevos enfoques terapéuticos que pueden reducir son necesarios recurrencia y progresión. El microambiente tumoral puede influir significativamente en el desarrollo del tumor y la respuesta al tratamiento. Por lo tanto, a menudo es deseable hacer crecer las células tumorales en el órgano del que se derivan. Este protocolo describe un modelo ortotópico de cáncer de vejiga, en el que las células de carcinoma de vejiga murino MB49 se instila en la vejiga a través de la cateterización. Implantación de células tumorales con éxito en este modelo requiere la interrupción de la capa protectora de glucosaminoglucano, que se puede lograr por medios físicos o químicos. En nuestro protocolo de la vejiga se trata con tripsina antes de la instilación de células. La cateterización de la vejiga también puede ser utilizado para entregar la terapéutica de una vez establecidos los tumores. Este protocolo describe la entrega de una construcción adenoviral que expresa un gen indicador de luciferasa. Si bien our protocolo ha sido optimizado para los estudios a corto plazo y se centra en la entrega de genes, la metodología de ratón cateterismo vesical tiene amplias aplicaciones.

Introduction

El cáncer de vejiga es el segundo cáncer más común del tracto urogenital, con cerca de 75.000 nuevos casos y 15.000 muertes esperadas en el 2012 ^1. Las altas tasas de recurrencia requieren seguimiento de por vida, lo que hace que el cáncer de vejiga uno de los cánceres más costosas de tratar. El cáncer de vejiga que ha invadido la capa muscular puede producir metástasis en el hígado, pulmón o hueso a través del sistema linfático. La terapia multimodal de tumores avanzados resultados en sólo 20-40% de supervivencia a los 5 años. Por lo tanto, las estrategias de tratamiento eficaces destinadas a reducir la recurrencia y progresión del cáncer superficial de vejiga, así como mejorar los resultados terapéuticos en los pacientes con enfermedad avanzada se necesitan con urgencia.

Desarrollo de nuevas terapias requiere modelos preclínicos para evaluar la eficacia después de la evaluación inicial in vitro. El microambiente tumoral puede influir significativamente en el desarrollo del cáncer y la capacidad de respuesta, lo que pone de relieve la necesidad de preclínicamodelos de AL en el que surgen los tumores o se pueden establecer en el órgano de origen. Un enfoque es el desarrollo de modelos transgénicos en los que surgen los tumores de forma espontánea o puede ser inducida en una manera específica de órgano. Una excelente protocolo de un modelo de cáncer de vejiga transgénico ha sido recientemente publicado ^2. El inconveniente de los modelos transgénicos es que los tumores tienden a desarrollarse lentamente y con menos uniformidad de lo deseado. Además, el costo de mantenimiento de una colonia de cría tiene que ser considerado. Una alternativa a modelos transgénicos es la implantación ortotópica de las células tumorales, que tiene la ventaja de marcos corto de tiempo para el establecimiento de tumores en ratones disponibles comercialmente. Mientras que algunas líneas celulares de cáncer de vejiga humanos se pueden cultivar de forma ortotópica (hemos utilizado con éxito UM-UC-3), puede ser deseable para establecer tumores en ratones inmunocompetentes. Dos líneas celulares de cáncer vesical murino, que crecen ortotópicamente son MBT-2 y MB49 ^3. Desde MBT-2 células están contaminados con la replicaciónretrovirus tipo C ^4, hemos elegido las células MB49 para nuestros estudios. Es importante señalar que las células MB49 fueron aisladas de un ratón macho y implantaciones ortotópico son por razones anatómicas realizados en ratones hembra. Esto tiene la ventaja de una fácil identificación de las células implantadas por marcadores del cromosoma Y, pero la falta de coincidencia de género puede ser un inconveniente para estudios inmunológicos.

El epitelio de la vejiga está revestida por una capa de glucosaminoglucano (GAG), que funciona como una barrera para la infección por microorganismos. Esta barrera también puede interferir con la implantación de las células tumorales y varios métodos se han desarrollado para superar esta dificultad (Tabla 1). Electrocauterio se ha utilizado ampliamente como un medio físico para interrumpir la capa GAG ^5-13 y un electrocauterio demostrando protocolo ha sido recientemente publicado en Jove ^14. Sin embargo, no debe estar disponible una unidad de electrocauterio, medios químicos para destruir el GAG capa tal como nitrato de plata o de poli-L-lisina también se puede utilizar ^15-24. Los tumores se establecieron de manera efectiva por una breve exposición de la vejiga a un pequeño volumen de nitrato de plata (5-10 l, 0,15 a 1,0 M, ~ 10 seg) o de contacto más largo con poli-L-lisina (100 l de 0,1 mg / ml durante 20 min) (Tabla 1). Aquí se describe un método que usa tripsina para facilitar la implantación de las células MB49.

En un intento de mejorar los enfoques terapéuticos para el cáncer de vejiga, la terapia génica ha llamado la atención significativa. Desde un punto de vista clínico, el cáncer de vejiga es un objetivo ideal para la terapia génica debido a la fácil accesibilidad del órgano y la capacidad de administrar localmente la carga útil. Los vectores virales que se han explorado para la terapia génica del cáncer de vejiga incluyen un virus oncolítico del herpes simple ^{25, 26} de retrovirus, virus de la viruela del canario ^27, virus de la vacuna, de AAV, y adenovirus ^28. En la segunda parte de nuestro protocolo, se describe un método para la entrega viral que es prácticamente idéntica a la instilación de las células tumorales. De interés en nuestro laboratorio es el desarrollo de nuevos enfoques para la entrega de genes, que evaluamos a través de la bioluminiscencia usando un vector adenoviral que expresa un transgen de la luciferasa. Sin embargo, la metodología de la cateterización de la vejiga puede ser utilizado para la entrega de diversos agentes y por lo tanto tiene una amplia aplicabilidad.

Protocol

Todos los procedimientos con animales han sido revisados ​​y aprobados por el Comité de Cuidado de Animales institucional y Uso de la Universidad Médica de Carolina del Sur. El protocolo fue aprobado por USDA categoría D para el dolor. 1. El implante de células Dos días antes de realizar el procedimiento, la placa 1 x 10 6 MB49 células en matraces T-25. El uso de alta glucosa DMEM suplementado con 10% de FBS (antibióticos y, si se desea). Un matraz es suficie…

Representative Results

La hematuria se observa en casi todos los ratones dentro de 8 días después de la implantación de las células MB49 200000. Como se muestra en la Figura 1, el peso de la vejiga es más del doble de 34,7 ± 3,3 mg (rango de 31-37 mg, n = 4) no tumoral en ratones portadores de 87,5 ± 19,2 mg (rango de 77 a 120 mg, n = 10) en ratones que han sido implantados con las células MB49. En términos de la entrega de genes, encontramos que las imágenes ratones 24 horas después de la instilación viral produc…

Discussion

La principal metodología descrita en este protocolo es la cateterización de la vejiga del ratón, que tiene amplias aplicaciones para la instilación de células o de cualquier agente destinado a la administración local en el epitelio de la vejiga. El protocolo específico descrito anteriormente ha sido optimizado para los estudios a corto plazo (~ 10 días). Implantar el número exacto de las células es fundamental, ya que un número mayor de células dará lugar a un crecimiento rápido del tumor más y, posibleme…

Materials

Name of reagent	Company	Catalog number	Comments
6-8 week old female mice	Jackson Laboratories	Strain Name: C57BL/6J Stock Number: 000664
Trypsin*	MediaTech	MT25-053-CI	Obtained through Fisher
DMEM*	MediaTech	MT10-017-CV	Obtained through Fisher
FBS	Hyclone	SH30071.03	Heat-inactivated
T25 flasks*	Corning Costar	Corning No.:3056 Fisher: 07-200-63	Obtained through Fisher
MB49 cells	N/A	N/A	Obtained from Dr. Boehle (see reference11)
Puralube Vet Ointment*	Pharmaderm	Henry Schein Company No.:036090-6050059 Fisher: NC9676869	Obtained through Fisher
Depilatory cream: Veet	local pharmacy
Lubricant: K-Y Jelly	local pharmacy
Catheters*	Exel International	Exel International No.:26751; Fisher: 14-841-21	Obtained through Fisher
Isoflurane	Terrell	NDC 66794-011-25	Obtained though hospital pharmacy
1 ml slip tip TB syringes	Becton Dickinson	BD309659 Fisher:14-823-434
D-Luciferin	Gold Biotechnologies	L-123-1
Ad-CMV-Luc	VectorBiolabs	1000; Request large scale amplification and CsCl purification for in vivo use	Infectious agent that requires BSL2 containment
Steady-Glo Luciferase Assay System	Promega	E2510 (10 ml), E2520 (100 ml), or E2550 (10 x 100 ml)

*available through multiple vendors

EQUIPMENT

Material name	Company	Catalog number	Comments
Anesthesia system	E-Z Systems, Euthanex Corporation	Anesthesia system: EZ7000 5-port mouse rebreathing device: EZ109	Obtained through Fisher
Xenogen IVIS 200	Caliper Life Sciences	http://www.caliperls.com/products/preclinical-imaging/ivis-imaging-system-200-series.htm
FLUOstar Optima	BMG Labtech	http://www.bmglabtech.com/products/microplate-reader/instruments.cfm?product_id=2