العزلة وتمايز الخلايا إلى خلايا الأوعية الدموية اللحمية بيج / برايت
Summary
يمكن أن تكون متباينة preadipocytes البيضاء الابتدائية معزولة عن الأنسجة الدهنية في الفئران البيضاء إلى خلايا بيج / برايت. قدم هنا هو نظام موثوق لدراسة نموذج الخلوية الجزيئية لتنظيم "براوننج" من الدهون البيضاء.
Abstract
الخلايا الشحمية البني لديها القدرة على فك الارتباط بين سلسلة الجهاز التنفسي في الميتوكوندريا وتبديد الطاقة الكيميائية في شكل حرارة. هو فعل شديدة تطوير UCP1 إيجابية الخلايا الشحمية براون في الأنسجة الدهنية البيضاء (ما يسمى الخلايا البيج أو برايت) من خلال مجموعة متنوعة من العظة البيئية مثل التعرض للبرد المزمن أو منبهات PPARγ، لذلك، وهذا نوع من الخلايا لديها امكانات كهدف العلاجية ل السمنة العلاج. ورغم أن معظم خطوط خلية شحمية خلد لا يمكن تلخيص عملية "إنضاج" من الدهون البيضاء في الثقافة والخلايا الشحمية الأساسية معزولة عن جزء الأوعية الدموية اللحمية في النسيج تحت الجلد الدهنية البيضاء (WAT) توفير نظام موثوق الخلوية لدراسة السيطرة الجزيئية لتطور الخلايا بيج / برايت . نحن هنا وصف بروتوكول للعزلة فعالة من preadipocytes الابتدائية ولإحداث تمايز الخلايا إلى البيج / برايت في الثقافة. ويمكن تقييم تأثير براوننج عن طريق التعبير عن علامة الدهون انتقائية البنيالمتطلبات البيئية مثل UCP1.
Introduction
السمنة هي زيادة في جميع أنحاء العالم بشكل كبير وتعتبر الآن واحدة من الاهتمامات الأكثر خطورة على الصحة العامة 1. ويرتبط هذا الشرط لmisbalance في استهلاك الطاقة النسبية للإنفاق والنتائج في تخزين الطاقة الزائدة كما الدهون في الأنسجة الدهنية البيضاء (WAT). ويرتبط WAT الموسع مع زيادة كتلة الجسم والوزن، في حين بني الأنسجة الدهنية لديه القدرة على تبديد الطاقة الزائدة لإنتاج الحرارة. بالتالي يمكن BAT يعمل وحماية ضد كل من البرد والسمنة 2،3. ويتحقق ذلك عن طريق uncoupling من نقل الإلكترون في الميتوكوندريا من Uncoupling البروتين 1 (UCP1). ويعتبر هذا البروتين علامة مميزة لتوليد الحرارة بلارعدة في BAT 3. كشفت العديد من الدراسات في السنوات الأخيرة أن يكون البشر البالغين 4-8 و BAT وظيفية، وبالتالي التلاعب BAT في البشر يمكن أن يكون التدخل العلاجي المحتملة في المعركة ضد البدانة والأمراض المرتبطة بها.
jove_content "> الأدلة الحالية تشير إلى أن نوعين من الخلايا الشحمية البنية موجودة في القوارض،" الكلاسيكية "أو" الموجودة من قبل "براون الدهون تطور خلال المرحلة السابقة للولادة وتشكل مستودعات مخصصة الدهنية في منطقة بين الكتفين البني والأنسجة الطرفية الأخرى من ناحية أخرى. ، وهو "محرض" شكل من أشكال الدهون البني (يسمى الخلايا برايت أو البيج) تطور خلال المرحلة ما بعد الولادة ويظهر يتخلل في الأنسجة الدهنية البيضاء. يتم فصل أيضا النوعين من الخلايا الشحمية من أصول بنى التنموية المختلفة. على الرغم من أن القائمة من قبل الخلايا الشحمية البنية تنشأ عن مثل myoblastsic Myf5 السلائف، ومحرض برايت / بيج الخلايا يتخلل في WAT تنشأ من النسب غير Myf5 9،10. وبالإضافة إلى ذلك، المسارات التنظيمية لهذا النوع من الخلايا ومن المرجح أن يكون مختلفا عن بني Myf5 المشتقة يمكن الخلايا الشحمية 11. تفعيل وتطوير الخلايا بيج (أي "براوننج" من الدهون البيضاء) ردا على التعرض للبرد المزمن وإلىβ3-المستقبلات ناهضات منبهات أو PPARγ في البالغين 12-14. الخلايا بيج / برايت من المحتمل أن تكون هدفا واعدا العلاجية للتلاعب من ميزان الطاقة الإجمالي ويمكن أن تصبح جزءا من المحتمل علاج السمنة، وبالتالي، فإنه من المهم أن نفهم الآليات الجزيئية الدقيقة ومسارات الإشارات التي تتحكم في الإشارات البيئية تطوير البيج الخلايا.لفهم التحكم الجزيئي للبراوننج من الدهون البيضاء، في التجارب المختبرية هي الأنسب والتفريق بين preadipocytes يحدث بشكل غير متزامن وليس وأنه من الصعب للكشف عن خلايا في 15 الموقع. على الرغم من أن الدراسات على التنمية خلية شحمية وحتى الآن تم تنفيذ خطوط الخلايا في المقام الأول على مثل 3T3-L1، F442A-3T3 أو HIB1، وهذه خطوط الخلايا يبدو تفتقر إلى توقيع الجزيئي للخلايا البيج. من ناحية أخرى، معزولة عن الخلايا الشحمية الأساسية WAT تحت الجلد هي الأكثر احتمالا أن ألخص في بروسسليالي براوننج من الدهون البيضاء في الأزياء حكم ذاتي الخلية. هنا نقدم بروتوكول لعزل الفعال لجزء من انسجة والأوعية الدموية والأنسجة الدهنية لإحداث براوننج من الدهون البيضاء استجابة لمنبهات PPARγ. وقد تبين أن تكون روزيجليتازون وسيطا فعالا خاصة في إنضاج هذه الخلايا. كما اقترح سابقا 16، يمكن استخدام هذا النظام لخدمة الخلوية نظام موثوق الخلوية لدراسة تطوير خلايا بيج / برايت.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا نقدم نظام موثوق الخلوية لدراسة تطوير خلايا بيج / برايت في الخلايا الشحمية مثقف الأولية في الفئران. بالمقارنة مع العديد من خطوط الخلايا خلد المتاحة، هذا النظام من المرجح أن تقدم أهمية تعزيز للبراوننج من الدهون البيضاء في الجسم الحي.
<p class="jove_content" style=";text-align:r…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر Haruya اونو، شينودا Kosaku، وشارب لويس، Tomoda إيمي، ورويز لورين للمناقشة، والمساعدة التقنية والمساعدة التحريرية على المخطوطة. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (DK087853)، من برنامج للبحوث الطبية الحيوية والاختراق من شركة فارم لAsubio SKULA أيده SHARE زمالات الدكتوراه من جامعة كوبنهاغن ومشروع الاتحاد الأوروبي FP7 DIABAT (HEALTH-F2 -2٬011-278٬373) لمادسن ليز وكارستن كريستيانسن. نعترف أيضا مركز DERC منحة (NIH P30 DK063720).
Materials
| Reagent | |||
| Collaginase D | Roche | 11088874103 | |
| Dispase II | Roche | 04942078001 | |
| CaCl2 | |||
| DMEM medium | Fisher | 10017-CV | With 2,5 g/l glucose & L-glutamine without sodium pyruvate |
| Insulin | |||
| T3 (3,3′,5-Triiodo-L-thyronine) | Sigma | T-2877 | |
| Indomethacin | Sigma | I-7378 | |
| Dexamethasone | Sigma | D-1756 | |
| IBMX | Sigma | I-5879 | |
| Rosiglitazone | Sigma | R-2408 | |
| Equipment | |||
| Collagen coated dishes | BD | 354450 | 10 cm plates |
| 70 μm filter | BD Falcon | 352350 | Cell strainer,70 μm nylon 1/ea |
References
- Barness, L. A., Opitz, J. M., Gilbert-Barness, E. Obesity: genetic, molecular, and environmental aspects. American Journal of Medical Genetics. Part A. 143A, 3016-3034 (2007).
- Rothwell, N. J., Stock, M. J. Combined effects of cafeteria and tube-feeding on energy balance in the rat. The Proceedings of the Nutrition Society. 38, 5A (1979).
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiological Reviews. 84, 277-359 (2004).
- Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. The New England Journal of Medicine. 360, 1509-1517 (2009).
- van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. The New England Journal of Medicine. 360, 1500-1508 (2009).
- Virtanen, K. A., et al. Functional brown adipose tissue in healthy adults. The New England Journal of Medicine. 360, 1518-1525 (2009).
- Zingaretti, M. C., et al. The presence of UCP1 demonstrates that metabolically active adipose tissue in the neck of adult humans truly represents brown adipose tissue. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 23, 3113-3120 (2009).
- Saito, M., et al. High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity. Diabetes. 58, 1526-1531 (2009).
- Seale, P., et al. PRDM16 controls a brown fat/skeletal muscle switch. Nature. 454, 961-967 (2008).
- Petrovic, N., et al. Chronic peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma) activation of epididymally derived white adipocyte cultures reveals a population of thermogenically competent, UCP1-containing adipocytes molecularly distinct from classic brown adipocytes. The Journal of Biological Chemistry. 285, 7153-7164 (2010).
- Coulter, A. A., Bearden, C. M., Liu, X., Koza, R. A., Kozak, L. P. Dietary fat interacts with QTLs controlling induction of Pgc-1 alpha and Ucp1 during conversion of white to brown fat. Physiological Genomics. 14, 139-147 (2003).
- Klingenspor, M. Cold-induced recruitment of brown adipose tissue thermogenesis. Experimental Physiology. 88, 141-148 (2003).
- Cinti, S. The adipose organ. Prostaglandins, leukotrienes, and essential fatty acids. 73, 9-15 (1016).
- Ghorbani, M., Himms-Hagen, J. Appearance of brown adipocytes in white adipose tissue during CL 316,243-induced reversal of obesity and diabetes in Zucker fa/fa rats. International Journal of Obesity and Related Metabolic Disorders: Journal of the International Association for the Study of Obesity. 21, 465-475 (1997).
- Hansen, J. B., Kristiansen, K. Regulatory circuits controlling white versus brown adipocyte differentiation. The Biochemical Journal. 398, 153-168 (2006).
- Ohno, H., Shinoda, K., Spiegelman, B. M., Kajimura, S. PPARy agonists induce a white-to-brown fat conversion through stabilization of PRDM16 protein. Cell metabolism. 15, 395-404 (2012).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Mottillo, E. P., Granneman, J. G. In vivo identification of bipotential adipocyte progenitors recruited by beta3-adrenoceptor activation and high-fat feeding. Cell Metabolism. 15, 480-491 (2012).
- Cinti, S. Transdifferentiation properties of adipocytes in the adipose organ. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 297, E977-E986 (2009).
- Barbatelli, G., et al. The emergence of cold-induced brown adipocytes in mouse white fat depots is determined predominantly by white to brown adipocyte transdifferentiation. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 298, E1244-E1253 (2010).
- Petrovic, N., et al. Chronic peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma) activation of epididymally derived white adipocyte cultures reveals a population of thermogenically competent, UCP1-containing adipocytes molecularly distinct from classic brown adipocytes. The Journal of Biological Chemistry. 285, 7153-7164 (2009).
- Rong, J. X., et al. Adipose mitochondrial biogenesis is suppressed in db/db and high-fat diet-fed mice and improved by rosiglitazone. Diabetes. 56, 1751-1760 (2007).
- Wilson-Fritch, L., et al. Mitochondrial remodeling in adipose tissue associated with obesity and treatment with rosiglitazone. The Journal of Clinical Investigation. 114, 1281-1289 (2004).
- Sell, H., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonism increases the capacity for sympathetically mediated thermogenesis in lean and ob/ob mice. Endocrinology. 145, 3925-3934 (2004).
- Fukui, Y., Masui, S., Osada, S., Umesono, K., Motojima, K. A new thiazolidinedione, NC-2100, which is a weak PPAR-gamma activator, exhibits potent antidiabetic effects and induces uncoupling protein 1 in white adipose tissue of KKAy obese mice. Diabetes. 49, 759-767 (2000).
- Vernochet, C., et al. C/EBPalpha and the corepressors CtBP1 and CtBP2 regulate repression of select visceral white adipose genes during induction of the brown phenotype in white adipocytes by peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonists. Molecular and Cellular Biology. 29, 4714-4728 (2009).
- Tai, T. A., et al. Activation of the nuclear receptor peroxisome proliferator-activated receptor gamma promotes brown adipocyte differentiation. The Journal of Biological Chemistry. 271, 29909-29914 (1996).
- Sugii, S., et al. PPARgamma activation in adipocytes is sufficient for systemic insulin sensitization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 22504-22509 (2009).
