Isolatie en differentiatie van Stroma vasculaire cellen te Beige / Brite Cellen
Summary
Primaire witte preadipocyten geïsoleerd van wit vetweefsel in muizen kunnen worden onderscheiden in beige / brite cellen. Hier wordt gepresenteerd is een betrouwbare cellulaire modelsysteem om de moleculaire regulatie van "bruinen" van wit vet te bestuderen.
Abstract
Bruine vetcellen hebben de mogelijkheid om de ademhalingsketen afgekoppeld mitochondria en afgevoerd chemische energie als warmte. Ontwikkeling van UCP1-positieve bruine vetcellen in wit vetweefsel (zogenaamde beige of brite cellen) wordt sterk geïnduceerd door een verscheidenheid aan omgevingsfactoren zoals chronische blootstelling aan kou of PPARy agonisten, dus dit celtype potentieel heeft als een therapeutisch doelwit voor behandeling van obesitas. Hoewel de meeste vereeuwigd adipocyt lijnen kunnen niet herhalen het proces van "bruinen" van wit vet in cultuur, primaire adipocyten geïsoleerd van stromale vasculaire fractie in subcutane wit vetweefsel (WAT) een betrouwbare cellulaire systeem om de moleculaire controle van beige / brite cel ontwikkeling te bestuderen . Hier beschrijven we een protocol voor effectieve isolatie van primaire preadipocyten en voor het induceren van differentiatie beige / brite cellen in kweek. Het bruinen effect kan worden beoordeeld door de expressie van bruin vet-selectieve merkers zoals UCP1.
Introduction
Obesitas is een dramatische toename van de hele wereld en wordt nu beschouwd als een van de meest ernstige bezorgdheid voor de volksgezondheid 1. Deze situatie heeft betrekking op een onbalans in energie-inname ten opzichte uitgaven en resultaten in overtollige energie opgeslagen als vet in wit vetweefsel (WAT). Vergrote WAT wordt in verband gebracht met een verhoogde body mass en gewicht, terwijl de bruine vetweefsel heeft de mogelijkheid om overtollige energie af te voeren om warmte te produceren. Vandaar BBT kan functioneren als bescherming tegen zowel kou en overgewicht 2,3. Dit wordt bereikt door ontkoppeling van het elektronentransport in mitochondria door ontkoppeling eiwit 1 (UCP1). Dit eiwit wordt beschouwd als een keurmerk voor nonshivering thermogenese in BAT 3. Verschillende studies in de afgelopen jaren is gebleken dat volwassen mensen functionele BAT vier-acht hebben en dus, manipulatie van de BBT bij de mens kan een potentiële therapeutische interventie in de strijd tegen overgewicht en de daarmee samenhangende ziekten.
jove_content "> Huidig bewijs geeft aan dat twee soorten bruine adipocyten in knaagdieren" klassieke "of" bestaande "bruin vet ontstaat tijdens de prenatale fase en vormt gewijd bruine adipose depots in interscapular regio en andere perifere weefsels Anderzijds. Een "induceerbare" vorm van bruin vet (zogenaamde brite of beige cellen) ontwikkelt tijdens postnatale fase en wordt afgewisseld in wit vetweefsel. Beide soorten bruine vetcellen ook gescheiden door verschillende ontwikkelingsstadia oorsprong. Terwijl de bestaande bruine vetcellen ontstaan uit myoblastsic-achtige Myf5 precursors, de induceerbare brite / beige cellen afgewisseld in WAT voortkomen uit een niet-Myf5 lineage 9,10. Bovendien regulerende pathways van dit celtype waarschijnlijk verschillen van de Myf5 afgeleide bruine adipocyten 11. de ontwikkeling van de beige cellen (bijv. "bruining" wit vet) kan worden geactiveerd in reactie op chronische blootstelling aan kou enβ3-adrenoceptor-agonisten of PPARy agonisten bij volwassenen 12-14. De beige / brite cellen waarschijnlijk een veelbelovend therapeutisch doel voor manipulatie van de totale energiebalans en kan deel kunnen uitmaken behandeling van obesitas, dus is het belangrijk om te begrijpen precieze moleculaire mechanismen en signaalwegen waarbij omgevingsfactoren controle van de ontwikkeling van beige cellen.Om de moleculaire controle van de bruining van wit vet begrijpen zijn in vitro experimenten best geschikt als differentiatie van preadipocyten plaatsvindt eerder asynchroon en het is moeilijk om de cellen te detecteren in situ 15. Hoewel studies op adipocyte ontwikkeling is tot nu toe voornamelijk uitgevoerd op cellijnen zoals 3T3-L1, 3T3-F442A of HIB1, deze cellijnen blijken het moleculaire profiel van beige cellen missen. Anderzijds, primaire adipocyten geïsoleerd uit subcutane WAT het meest waarschijnlijk het proces herhalens van bruinkleuring van wit vet in een cel autonome manier. Hier bieden wij een protocol voor een effectieve isolatie van het stromale-vasculaire fractie uit vetweefsel en voor het induceren van de bruinkleuring van wit vet in reactie op PPAR-agonisten. Rosiglitazon is aangetoond dat een bijzonder effectieve mediator van bruin in deze cellen. Zoals hiervoor 16 kan dit cellulaire systeem gebruikt worden om een betrouwbare cellulaire systeem om de ontwikkeling van beige / brite cellen te bestuderen dienen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier wordt een betrouwbare cellulaire systeem om de ontwikkeling van beige / brite cellen in primaire gekweekte adipocyten in muizen. Vergeleken met verschillende beschikbare geïmmortaliseerde cellijnen, dit systeem waarschijnlijk grotere relevantie voor het bruinen van witte vet in vivo bieden.
Hoewel in de studie van deze primaire adipocyten biedt een aantal voordelen, bestaan er ook een aantal beperkingen en problemen die van belang zijn om te overwegen. Eerst is dit syste…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Haruya Ohno, Kosaku Shinoda, Louis Sharp, Emi Tomoda, en Lauren Ruiz voor discussie, technische hulp en redactionele hulp op het manuscript. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de NIH (DK087853), van het Programma voor Doorbraak biomedisch onderzoek en van Asubio Pharm Inc Skula werd ondersteund door een SHARE PhD beurzen van de Universiteit van Kopenhagen en het EU-FP7 project Diabat (GEZONDHEID-F2 -2,011 tot 278,373) naar Lise Madsen en Karsten Kristiansen. We erkennen ook het DERC centrum subsidie (NIH P30 DK063720).
Materials
| Reagent | |||
| Collaginase D | Roche | 11088874103 | |
| Dispase II | Roche | 04942078001 | |
| CaCl2 | |||
| DMEM medium | Fisher | 10017-CV | With 2,5 g/l glucose & L-glutamine without sodium pyruvate |
| Insulin | |||
| T3 (3,3′,5-Triiodo-L-thyronine) | Sigma | T-2877 | |
| Indomethacin | Sigma | I-7378 | |
| Dexamethasone | Sigma | D-1756 | |
| IBMX | Sigma | I-5879 | |
| Rosiglitazone | Sigma | R-2408 | |
| Equipment | |||
| Collagen coated dishes | BD | 354450 | 10 cm plates |
| 70 μm filter | BD Falcon | 352350 | Cell strainer,70 μm nylon 1/ea |
References
- Barness, L. A., Opitz, J. M., Gilbert-Barness, E. Obesity: genetic, molecular, and environmental aspects. American Journal of Medical Genetics. Part A. 143A, 3016-3034 (2007).
- Rothwell, N. J., Stock, M. J. Combined effects of cafeteria and tube-feeding on energy balance in the rat. The Proceedings of the Nutrition Society. 38, 5A (1979).
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiological Reviews. 84, 277-359 (2004).
- Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. The New England Journal of Medicine. 360, 1509-1517 (2009).
- van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. The New England Journal of Medicine. 360, 1500-1508 (2009).
- Virtanen, K. A., et al. Functional brown adipose tissue in healthy adults. The New England Journal of Medicine. 360, 1518-1525 (2009).
- Zingaretti, M. C., et al. The presence of UCP1 demonstrates that metabolically active adipose tissue in the neck of adult humans truly represents brown adipose tissue. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 23, 3113-3120 (2009).
- Saito, M., et al. High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity. Diabetes. 58, 1526-1531 (2009).
- Seale, P., et al. PRDM16 controls a brown fat/skeletal muscle switch. Nature. 454, 961-967 (2008).
- Petrovic, N., et al. Chronic peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma) activation of epididymally derived white adipocyte cultures reveals a population of thermogenically competent, UCP1-containing adipocytes molecularly distinct from classic brown adipocytes. The Journal of Biological Chemistry. 285, 7153-7164 (2010).
- Coulter, A. A., Bearden, C. M., Liu, X., Koza, R. A., Kozak, L. P. Dietary fat interacts with QTLs controlling induction of Pgc-1 alpha and Ucp1 during conversion of white to brown fat. Physiological Genomics. 14, 139-147 (2003).
- Klingenspor, M. Cold-induced recruitment of brown adipose tissue thermogenesis. Experimental Physiology. 88, 141-148 (2003).
- Cinti, S. The adipose organ. Prostaglandins, leukotrienes, and essential fatty acids. 73, 9-15 (1016).
- Ghorbani, M., Himms-Hagen, J. Appearance of brown adipocytes in white adipose tissue during CL 316,243-induced reversal of obesity and diabetes in Zucker fa/fa rats. International Journal of Obesity and Related Metabolic Disorders: Journal of the International Association for the Study of Obesity. 21, 465-475 (1997).
- Hansen, J. B., Kristiansen, K. Regulatory circuits controlling white versus brown adipocyte differentiation. The Biochemical Journal. 398, 153-168 (2006).
- Ohno, H., Shinoda, K., Spiegelman, B. M., Kajimura, S. PPARy agonists induce a white-to-brown fat conversion through stabilization of PRDM16 protein. Cell metabolism. 15, 395-404 (2012).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Mottillo, E. P., Granneman, J. G. In vivo identification of bipotential adipocyte progenitors recruited by beta3-adrenoceptor activation and high-fat feeding. Cell Metabolism. 15, 480-491 (2012).
- Cinti, S. Transdifferentiation properties of adipocytes in the adipose organ. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 297, E977-E986 (2009).
- Barbatelli, G., et al. The emergence of cold-induced brown adipocytes in mouse white fat depots is determined predominantly by white to brown adipocyte transdifferentiation. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 298, E1244-E1253 (2010).
- Petrovic, N., et al. Chronic peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma) activation of epididymally derived white adipocyte cultures reveals a population of thermogenically competent, UCP1-containing adipocytes molecularly distinct from classic brown adipocytes. The Journal of Biological Chemistry. 285, 7153-7164 (2009).
- Rong, J. X., et al. Adipose mitochondrial biogenesis is suppressed in db/db and high-fat diet-fed mice and improved by rosiglitazone. Diabetes. 56, 1751-1760 (2007).
- Wilson-Fritch, L., et al. Mitochondrial remodeling in adipose tissue associated with obesity and treatment with rosiglitazone. The Journal of Clinical Investigation. 114, 1281-1289 (2004).
- Sell, H., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonism increases the capacity for sympathetically mediated thermogenesis in lean and ob/ob mice. Endocrinology. 145, 3925-3934 (2004).
- Fukui, Y., Masui, S., Osada, S., Umesono, K., Motojima, K. A new thiazolidinedione, NC-2100, which is a weak PPAR-gamma activator, exhibits potent antidiabetic effects and induces uncoupling protein 1 in white adipose tissue of KKAy obese mice. Diabetes. 49, 759-767 (2000).
- Vernochet, C., et al. C/EBPalpha and the corepressors CtBP1 and CtBP2 regulate repression of select visceral white adipose genes during induction of the brown phenotype in white adipocytes by peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonists. Molecular and Cellular Biology. 29, 4714-4728 (2009).
- Tai, T. A., et al. Activation of the nuclear receptor peroxisome proliferator-activated receptor gamma promotes brown adipocyte differentiation. The Journal of Biological Chemistry. 271, 29909-29914 (1996).
- Sugii, S., et al. PPARgamma activation in adipocytes is sufficient for systemic insulin sensitization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 22504-22509 (2009).
