Aislamiento y diferenciación de las células del estroma vascular a células Beige / Brite
Summary
Preadipocitos primarios blancas aisladas de tejidos adiposos blancos en ratones se pueden diferenciar en células beige / brite. Se presenta aquí un sistema fiable modelo celular para estudiar la regulación molecular de "color" de la grasa blanca.
Abstract
Adipocitos marrones tienen la capacidad de desacoplar la cadena respiratoria en las mitocondrias y disipar la energía química en forma de calor. Desarrollo de UCP1-positivas adipocitos marrones en los tejidos adiposos blancos (llamados células beige o brite) se induce por una variedad de señales ambientales tales como la exposición al frío crónica o por agonistas PPAR, por lo tanto, este tipo de célula tiene potencial como una diana terapéutica para tratamiento de la obesidad. Aunque la mayoría de inmortalizadas líneas de adipocitos no puede recapitular el proceso de "color" de la grasa blanca en cultivo, adipocitos primarios aislados de la fracción del estroma vascular en el tejido subcutáneo adiposo blanco (WAT) proporcionar un sistema celular fiable para estudiar el control molecular de desarrollo de las células beige / brite . Aquí se describe un protocolo para el aislamiento eficaz de los preadipocitos primarios y para inducir la diferenciación de células de color beige / brite en cultivo. El efecto de dorado se puede evaluar mediante la expresión de la grasa marrón selectivo marcaERS tales como UCP1.
Introduction
La obesidad es el aumento dramáticamente en todo el mundo y ahora se considera uno de los problemas más graves para la salud pública 1. Esta condición está relacionada con un desequilibrio en la ingesta de energía relativa a los gastos y resultados en el exceso de energía almacenada en forma de lípidos en el tejido adiposo blanco (WAT). WAT ampliada se asocia con una mayor masa corporal y el peso, mientras que el tejido adiposo marrón tiene la capacidad de disipar el exceso de energía para producir calor. Por lo tanto BAT puede funcionar como protección contra el frío y la obesidad 2,3. Esto se consigue mediante desacoplamiento del transporte de electrones en la mitocondria por la disociación de proteínas 1 (UCP1). Esta proteína se considera una característica de termogénesis sin BAT en 3. Varios estudios realizados en años recientes han revelado que los humanos adultos tienen funcional 4-8 BAT y, en consecuencia, la manipulación de las MTD en los seres humanos puede ser una intervención terapéutica potencial en la lucha contra la obesidad y sus enfermedades relacionadas.
jove_content "pruebas> actual indica que hay dos tipos de adipocitos marrones existen en los roedores;" clásica "o" pre-existentes "grasa parda se desarrolla durante la etapa prenatal y forma dedicados depósitos adiposos marrones en región interescapular y otros tejidos periféricos En la otra mano. , un "inducible" forma de grasa marrón (así llamadas células Brite o beige) se desarrolla durante la etapa post-natal y aparece intercaladas en el tejido adiposo blanco. Los dos tipos de adipocitos marrones también son separadas por diferentes orígenes del desarrollo. Si bien la pre-existente adipocitos marrones surgen de myoblastsic-Myf5 como precursores, los inducibles brite / beige células intercaladas en WAT surgen de un linaje no Myf5 9,10. Además, las vías de regulación de este tipo de célula es probable que sea diferente de la marrón Myf5 derivado adipocitos 11. El desarrollo de las células de color beige (es decir, "cambio de color" blanco de grasa) puede ser activada en respuesta a la exposición al frío y crónica aβ3-adrenérgicos agonistas o agonistas de PPAR en adultos 12-14. Las células de color beige / brite es probable que sean un objetivo terapéutico prometedor para la manipulación de balance global de energía y, potencialmente, puede convertirse en parte del tratamiento de la obesidad, por lo que es importante para comprender los mecanismos moleculares precisos y vías de señalización por señales ambientales que controlan el desarrollo de color beige las células.Para comprender el control molecular de la pardeamiento de la grasa blanca, en experimentos in vitro son los más adecuados como la diferenciación de los preadipocitos tiene lugar más bien de forma asíncrona y es difícil de detectar las células in situ 15. Aunque los estudios sobre el desarrollo de los adipocitos hasta ahora se han realizado principalmente en líneas celulares tales como, 3T3-L1 3T3-F442A o HIB1, estas líneas celulares parecen carecer de la firma molecular de las células de color beige. Por otro lado, los adipocitos primarios aislados desde la inyección subcutánea WAT tienen más probabilidades de recapitular los process de pardeamiento de la grasa blanca de forma autónoma celular. Aquí se proporciona un protocolo para el aislamiento eficaz de la fracción estromal-vascular de tejidos adiposos y para inducir el bronceado de grasa blanca en respuesta a los agonistas de PPAR. Rosiglitazona se ha demostrado que es un mediador especialmente eficaz de pardeamiento en estas células. Como se sugirió anteriormente 16, este sistema celular se puede utilizar para servir a un sistema fiable celular para estudiar el desarrollo de las células de color beige / brite.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí presentamos un sistema fiable celular para estudiar el desarrollo de las células de color beige / brite en la enseñanza primaria adipocitos cultivados en ratones. En comparación con varias líneas celulares inmortalizadas disponibles, este sistema es probable que ofrezca mayor relevancia para el pardeamiento de la grasa blanca in vivo.
A pesar de que el estudio de estos adipocitos primarios ofrece algunas ventajas, también existen algunas limitaciones y preocupaciones que …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias a Haruya Ohno, Shinoda Kosaku, Sharp Louis, Tomoda Emi, y Lauren Ruiz de discusión, ayuda técnica y asistencia editorial sobre el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por becas de los NIH (DK087853), del Programa de Investigación Biomédica y de Breakthrough Asubio Pharm Inc. para SKULA fue apoyado por una COMPARTIR becas de doctorado de la Universidad de Copenhague y la UE FP7 proyecto Diabat (SALUD-F2 -2,011-278.373) a Lise Madsen y Kristiansen Karsten. También reconocemos la DERC centro subvención (NIH P30 DK063720).
Materials
| Reagent | |||
| Collaginase D | Roche | 11088874103 | |
| Dispase II | Roche | 04942078001 | |
| CaCl2 | |||
| DMEM medium | Fisher | 10017-CV | With 2,5 g/l glucose & L-glutamine without sodium pyruvate |
| Insulin | |||
| T3 (3,3′,5-Triiodo-L-thyronine) | Sigma | T-2877 | |
| Indomethacin | Sigma | I-7378 | |
| Dexamethasone | Sigma | D-1756 | |
| IBMX | Sigma | I-5879 | |
| Rosiglitazone | Sigma | R-2408 | |
| Equipment | |||
| Collagen coated dishes | BD | 354450 | 10 cm plates |
| 70 μm filter | BD Falcon | 352350 | Cell strainer,70 μm nylon 1/ea |
References
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