Summary

Bej / Brite Hücreler Stromal Vasküler Hücre İzolasyonu ve Farklılaşma

Published: March 28, 2013
doi:

Summary

Farelerde beyaz adipoz dokulardan izole İlköğretim beyaz preadipositlerden bej / brite hücrelerine ayırt edilebilir. Burada sunulan beyaz yağ "esmerleşme" moleküler düzenlenmesi okumak için güvenilir hücresel modeli sistemidir.

Abstract

Kahverengi adipositler mitokondrilerde solunum zinciri ayırınız ve ısı gibi kimyasal enerjiyi için yeteneği var. Beyaz adipoz doku (yani bej veya brite hücreler olarak adlandırılır) UCP1 pozitif kahverengi adipositlerin Kalkınma yüksek kronik soğuğa maruz kalma ya da PPARy agonistleri tarafından çevresel işaretlerin çeşitli neden, bu nedenle, bu hücre tipi için bir terapötik hedef olarak potansiyele sahip obezite tedavisinde. Çoğu ölümsüzleştirdi adiposit hatları kültüründe beyaz yağ "esmerleşme" süreci özetleyen edemesek de, birincil adipositler brite / bej hücre gelişiminin moleküler kontrolü çalışmak için güvenilir hücresel sistem sağlamak subkütan beyaz adipoz dokuda stromal vasküler fraksiyon (WAT) izole . Burada primer preadipositlerden etkin izolasyonu ve kültür bej / brite hücrelerine farklılaşma inducing için bir protokol açıklar. Esmerleşme efekti kahverengi yağ seçici işareti ifade tarafından tespit edilebilirBöyle UCP1 gibi ers.

Introduction

Obezite ölçüde dünya çapında artan ve şu anda halk sağlığı 1 için en ciddi kaygılarından biri olarak kabul edilir. Bu durum bir harcama enerji alımı göreli misbalance ve beyaz yağ dokusu (WAT) lipid olarak depolanan fazla enerji sonuçları ile ilgilidir. Kahverengi adipoz dokuda ısı üretmek için fazla enerjiyi dağıtmak için yeteneğine sahipken Büyümüş WAT, artan vücut kütlesi ve ağırlığı ile ilişkilidir. Bu nedenle BAT soğuk ve obezite 2,3 hem de karşı koruma olarak işlev görebilir. Bu protein 1 (UCP1) ile ayrılmasının mitokondri içinde elektron nakil bölgesinin ayrılmasının elde edilir. Bu protein, BAT 3 termojenez nonshivering için ayırt edici bir özelliği olarak kabul edilir. Son yıllarda çeşitli çalışmalar erişkin insanlarda fonksiyonel BAT 4-8 var ve dolayısıyla insanlarda BAT manipülasyon obezite ve ilgili hastalıklara karşı savaşta potansiyel bir terapötik girişim olabileceğini ortaya koymuştur.

jove_content "> Mevcut kanıtlar kahverengi adiposit iki tip kemirgenlerde bulunduğunu gösterir," klasik "ya da" önceden mevcut olan "kahverengi yağ doğum öncesi aşama sırasında ortaya çıkar ve interskapular ve diğer periferik dokularda adanmış kahverengi yağ deposu oluşturan diğer taraftan. , kahverengi yağ (yani brite veya bej hücreler denir) bir "indüklenebilir" şeklinde doğum sonrası aşamasında gelişir ve beyaz adipoz dokularında serpiştirilmiş görünür. kahverengi adipositlerin iki tip de farklı gelişimsel kökenleri ile ayrılır. önceden mevcut iken kahverengi adipositler Myf5 öncüleri myoblastsic gibi ortaya çıkar, WAT olarak serpiştirilmiş indüklenebilir bej / brite hücre dışı bir Myf5 soy 9,10 ortaya çıkar. Buna ek olarak, bu tip hücre düzenleyici yollar Myf5 türevi kahverengi farklı olması muhtemeldir adipositler 11. bej hücreleri (beyaz yağ yani "esmerleşme") gelişimi kronik soğuk maruziyeti ve yanıt olarak aktive edilebilirβ3-adrenoseptör agonistler veya yetişkin 12-14 yılında PPARy agonistleri. Bej / brite hücreler genel enerji dengesi manipülasyonu için umut verici bir terapötik hedef olması muhtemel ve potansiyel obezite tedavisinin bir parçası haline gelebilir, bu nedenle, çevresel ipuçları bej gelişimini kontrol hangi hassas moleküler mekanizmaları ve sinyal yolları anlamak önemlidir hücreler.

Beyaz yağ esmerleşme moleküler kontrolünü anlamak için, in vitro deneylerde iyi preadipositlerden oldukça uyumsuz gerçekleşir farklılaşması olarak uygun ve yerinde 15 hücreleri tespit etmek zordur. Adiposit geliştirme çalışmaları, şimdiye kadar bu tür 3T3-L1, 3T3-F442A veya HIB1 gibi hücre soyları üzerine esas olarak gösterilmiş olsa da, bu hücre hatları bej hücre moleküler imza eksikliği görülmektedir. Diğer taraftan, derialtı WAT izole birincil adipositler süreç yeniden özetlemek için büyük olasılıklaBir hücre özerk moda beyaz yağ esmerleşme s. Burada yağ dokularından stromal-vasküler fraksiyonun etkili izolasyonu için ve PPARy agonistleri yanıt olarak beyaz yağ kahverengileşme indüklenmesi için bir protokol sağlar. Rosiglitazon, bu hücrelerde esmerleşmenin özellikle etkili bir aracı olduğu gösterilmiştir. 16. Daha önce de belirtildiği gibi, bu hücresel sistem bej / brite hücrelerinin gelişimini incelemek için güvenilir bir hücresel sistem hizmet etmek için de kullanılabilir.

Protocol

1. Sindirim Orta hazırlayın Doku başına 5 fare (yaklaşık 1 ml / 1 g yağ dokusu) başına 5 ml olun. Sindirim enzimleri tartılır: – Collaginase D: 1.5 u / ml (1108874103, 1 g, Roche, 70334223) – Dispase II: 2.4 u / ml (04942078001, 0,980 mg / lyo, Roche, 11466200) 25 ml PBS ekleyin ve çözünmesi için iyice karıştırın 10 mM nihai bir konsantrasyonda doku sindirim hemen önce CaCI2 eklemek 2…

Representative Results

Birincil adipositlerin Browning mRNA Ucp1 ifade ve qRT-PCR ile diğer kahverengi yağ-spesifik veya seçici genler ölçerek erişilebilir. Şekil 1'de Sunan inguinal WAT-kökenli birincil adipositlerde gen ekspresyonu veridir. Hücreler, sırasıyla 50 nM ve 500 nM de rosiglitazon iki farklı dozda varlığında ayırt etmek için oluşturuldu. Hücrelerinin bir alt kümesi, hasattan önce 4 saat boyunca 10 uM forskolin ile de muamele edilmiştir. Bu hücrelerde siklik-AMP (cAMP) teşvik v…

Discussion

Burada farelerde primer kültürlerinde adipositlerde bej / brite hücrelerinin gelişimini incelemek için güvenilir bir hücresel sistem sunuyoruz. Gibi çeşitli mevcut ölümsüzleştirilmiş hücre soyları ile karşılaştırıldığında, bu sistem, in vivo beyaz yağ kahverengileşme ile geliştirilmiş İlgiye sunmak için olasıdır.

Bu birincil adipositlerin çalışmanın bazı avantajlar sunuyor olsa da, orada da düşünülmesi gereken önemli bazı sınırlamalar ve …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Biz tartışma, teknik yardım ve el yazması üzerinde editoryal yardım için Haruya Ohno, Kosaku Shinoda, Louis Sharp, Emi Tomoda ve Lauren Ruiz ederim. Bu çalışma Atılım Biyomedikal Araştırma ve Asubio Ecz Inc için Programı SKULA için NIH (DK087853), hibe Kopenhag ve AB 7.ÇP Proje Diabat (SAĞLIK-F2 Üniversitesi'nden HİSSE doktora bursları ile desteklenmiştir tarafından desteklenmiştir Lise Madsen ve Karsten Kristiansen için -2.011-278373). Biz de DERC merkezi hibe (NIH P30 DK063720) kabul etmektesiniz.

Materials

Reagent
Collaginase D Roche 11088874103
Dispase II Roche 04942078001
CaCl2
DMEM medium Fisher 10017-CV With 2,5 g/l glucose & L-glutamine without sodium pyruvate
Insulin
T3 (3,3′,5-Triiodo-L-thyronine) Sigma T-2877
Indomethacin Sigma I-7378
Dexamethasone Sigma D-1756
IBMX Sigma I-5879
Rosiglitazone Sigma R-2408
Equipment
Collagen coated dishes BD 354450 10 cm plates
70 μm filter BD Falcon 352350 Cell strainer,70 μm nylon 1/ea

References

  1. Barness, L. A., Opitz, J. M., Gilbert-Barness, E. Obesity: genetic, molecular, and environmental aspects. American Journal of Medical Genetics. Part A. 143A, 3016-3034 (2007).
  2. Rothwell, N. J., Stock, M. J. Combined effects of cafeteria and tube-feeding on energy balance in the rat. The Proceedings of the Nutrition Society. 38, 5A (1979).
  3. Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiological Reviews. 84, 277-359 (2004).
  4. Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. The New England Journal of Medicine. 360, 1509-1517 (2009).
  5. van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. The New England Journal of Medicine. 360, 1500-1508 (2009).
  6. Virtanen, K. A., et al. Functional brown adipose tissue in healthy adults. The New England Journal of Medicine. 360, 1518-1525 (2009).
  7. Zingaretti, M. C., et al. The presence of UCP1 demonstrates that metabolically active adipose tissue in the neck of adult humans truly represents brown adipose tissue. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 23, 3113-3120 (2009).
  8. Saito, M., et al. High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity. Diabetes. 58, 1526-1531 (2009).
  9. Seale, P., et al. PRDM16 controls a brown fat/skeletal muscle switch. Nature. 454, 961-967 (2008).
  10. Petrovic, N., et al. Chronic peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma) activation of epididymally derived white adipocyte cultures reveals a population of thermogenically competent, UCP1-containing adipocytes molecularly distinct from classic brown adipocytes. The Journal of Biological Chemistry. 285, 7153-7164 (2010).
  11. Coulter, A. A., Bearden, C. M., Liu, X., Koza, R. A., Kozak, L. P. Dietary fat interacts with QTLs controlling induction of Pgc-1 alpha and Ucp1 during conversion of white to brown fat. Physiological Genomics. 14, 139-147 (2003).
  12. Klingenspor, M. Cold-induced recruitment of brown adipose tissue thermogenesis. Experimental Physiology. 88, 141-148 (2003).
  13. Cinti, S. The adipose organ. Prostaglandins, leukotrienes, and essential fatty acids. 73, 9-15 (1016).
  14. Ghorbani, M., Himms-Hagen, J. Appearance of brown adipocytes in white adipose tissue during CL 316,243-induced reversal of obesity and diabetes in Zucker fa/fa rats. International Journal of Obesity and Related Metabolic Disorders: Journal of the International Association for the Study of Obesity. 21, 465-475 (1997).
  15. Hansen, J. B., Kristiansen, K. Regulatory circuits controlling white versus brown adipocyte differentiation. The Biochemical Journal. 398, 153-168 (2006).
  16. Ohno, H., Shinoda, K., Spiegelman, B. M., Kajimura, S. PPARy agonists induce a white-to-brown fat conversion through stabilization of PRDM16 protein. Cell metabolism. 15, 395-404 (2012).
  17. Lee, Y. H., Petkova, A. P., Mottillo, E. P., Granneman, J. G. In vivo identification of bipotential adipocyte progenitors recruited by beta3-adrenoceptor activation and high-fat feeding. Cell Metabolism. 15, 480-491 (2012).
  18. Cinti, S. Transdifferentiation properties of adipocytes in the adipose organ. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 297, E977-E986 (2009).
  19. Barbatelli, G., et al. The emergence of cold-induced brown adipocytes in mouse white fat depots is determined predominantly by white to brown adipocyte transdifferentiation. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 298, E1244-E1253 (2010).
  20. Petrovic, N., et al. Chronic peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma) activation of epididymally derived white adipocyte cultures reveals a population of thermogenically competent, UCP1-containing adipocytes molecularly distinct from classic brown adipocytes. The Journal of Biological Chemistry. 285, 7153-7164 (2009).
  21. Rong, J. X., et al. Adipose mitochondrial biogenesis is suppressed in db/db and high-fat diet-fed mice and improved by rosiglitazone. Diabetes. 56, 1751-1760 (2007).
  22. Wilson-Fritch, L., et al. Mitochondrial remodeling in adipose tissue associated with obesity and treatment with rosiglitazone. The Journal of Clinical Investigation. 114, 1281-1289 (2004).
  23. Sell, H., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonism increases the capacity for sympathetically mediated thermogenesis in lean and ob/ob mice. Endocrinology. 145, 3925-3934 (2004).
  24. Fukui, Y., Masui, S., Osada, S., Umesono, K., Motojima, K. A new thiazolidinedione, NC-2100, which is a weak PPAR-gamma activator, exhibits potent antidiabetic effects and induces uncoupling protein 1 in white adipose tissue of KKAy obese mice. Diabetes. 49, 759-767 (2000).
  25. Vernochet, C., et al. C/EBPalpha and the corepressors CtBP1 and CtBP2 regulate repression of select visceral white adipose genes during induction of the brown phenotype in white adipocytes by peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonists. Molecular and Cellular Biology. 29, 4714-4728 (2009).
  26. Tai, T. A., et al. Activation of the nuclear receptor peroxisome proliferator-activated receptor gamma promotes brown adipocyte differentiation. The Journal of Biological Chemistry. 271, 29909-29914 (1996).
  27. Sugii, S., et al. PPARgamma activation in adipocytes is sufficient for systemic insulin sensitization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 22504-22509 (2009).
check_url/50191?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Liisberg Aune, U., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells. J. Vis. Exp. (73), e50191, doi:10.3791/50191 (2013).

View Video