Isolamento e diferenciação de células estromais vasculares para Células Bege / Brite
Summary
Principais pré-adipócitos brancos isolados de tecidos adiposos brancos em ratos podem ser diferenciadas em células bege / brite. Apresentado aqui é um sistema modelo celular fiável para estudar a regulação molecular de "escurecimento" da gordura branca.
Abstract
Adipócitos marrons tem a capacidade de dissociar a cadeia respiratória nas mitocôndrias e dissipar a energia química na forma de calor. Desenvolvimento da UCP1-positivos adipócitos marrons em tecidos adiposos brancos (as chamadas células bege ou brite) é altamente induzida por uma variedade de estímulos ambientais, tais como a exposição ao frio ou crónica por agonistas PPARy, portanto, esse tipo de célula tem potencial como um alvo terapêutico para tratamento da obesidade. Embora a maioria das linhas de adipócitos imortalizados não pode recapitular o processo de "escurecimento" da gordura branca na cultura, os adipócitos primários isolados da fração vascular estromal no tecido adiposo subcutâneo branco (WAT) fornecer um sistema confiável celular para estudar o controle molecular de bege / brite desenvolvimento de células . Aqui descrevemos um protocolo para isolamento eficaz de pré-adipócitos primários e para a indução de diferenciação de células bege / brite em cultura. O efeito de escurecimento pode ser avaliada através da expressão de marca selectiva gordura marromers como UCP1.
Introduction
A obesidade é dramaticamente mundial de aumento e agora é considerado uma das preocupações mais graves para a saúde pública 1. Esta condição está relacionada a um desequilíbrio em relação a ingestão de energia a despesa e resulta em excesso de energia armazenada como lípidos em tecido adiposo branco (WAT). WAT alargada está associada com aumento da massa corporal e do peso, enquanto que o tecido adiposo castanho tem a capacidade de dissipar o excesso de energia para produção de calor. Daí BAT pode funcionar como proteção contra o frio e obesidade 2,3. Isto é conseguido através do desacoplamento de transporte de electrões das mitocôndrias pela proteína desacopladora 1 (UCP1). Esta proteína é considerado um marco para a termogênese sem BAT em 3. Vários estudos nos últimos anos revelou que os seres humanos adultos têm funcional BAT 4-8 e, consequentemente, a manipulação da BAT em seres humanos pode ser uma intervenção potencial terapêutico na batalha contra a obesidade e suas doenças relacionadas.
jove_content "> evidência corrente indica que os dois tipos de adipócitos marrons existir em roedores;" clássica "ou" pré-existente "gordura marrom se desenvolve durante a fase pré-natal e forma depósitos de gordura marrom dedicados na região interescapular e outros tecidos periféricos Por outro lado. , um "induzível" forma de gordura marrom (assim chamadas células brite ou bege) desenvolve durante a fase pós-natal e aparece intercalada nos tecidos adiposos brancos. Os dois tipos de adipócitos marrons também são separadas por diferentes origens desenvolvimentistas. Enquanto a pré-existente adipócitos marrons surgem myoblastsic-like Myf5 precursores, os indutíveis brite / bege células intercaladas em WAT surgir a partir de uma linhagem não Myf5 9,10. Além disso, as vias de regulação deste tipo de células é susceptível de ser diferente do marrom Myf5 derivado 11. adipócitos O desenvolvimento das células (isto é, bege "escurecimento" branco de gordura) pode ser activado em resposta à exposição ao frio e à crónicaβ3-adrenérgicos agonistas ou agonistas PPARy em adultos 12-14. As células bege / brite são susceptíveis de constituir um alvo terapêutico promissor para a manipulação do equilíbrio energético geral e pode potencialmente tornar-se parte do tratamento da obesidade, portanto, é importante compreender os mecanismos moleculares precisos e caminhos de sinalização através dos quais estímulos ambientais controlam o desenvolvimento de cor bege células.Para compreender o controlo molecular do escurecimento de gordura branca, em experiências in vitro são os mais adequados como diferenciação de pré-adipócitos em vez ocorre de forma assíncrona, e é difícil de detectar as células em 15 situ. Embora os estudos sobre o desenvolvimento dos adipócitos têm até agora sido realizada principalmente em linhas de células, tais como células 3T3-L1, 3T3-F442A ou HIB1, estas linhas celulares parecem não ter a assinatura molecular de células de bege. Por outro lado, os adipócitos primários isolados de WAT subcutânea são mais susceptíveis de recapitular o process do escurecimento da gordura branca em uma forma de célula autônoma. Aqui nós fornecemos um protocolo para o isolamento eficaz da fracção do estroma vascular a partir de tecido adiposo e para induzir o escurecimento da gordura branca em resposta a agonistas de PPARy. Rosiglitazona foi demonstrado ser um mediador especialmente eficaz de escurecimento nessas células. Tal como anteriormente sugerido 16, este sistema celular pode ser utilizada para servir um sistema fiável celular para estudar o desenvolvimento de células bege / brite.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui apresentamos um sistema confiável celular para estudar o desenvolvimento de células bege / brite em adipócitos primários cultivados em camundongos. Em comparação com várias linhas de células imortalizadas disponíveis, este sistema é susceptível de oferecer relevância melhorada para o escurecimento do branco gordura in vivo.
Mesmo que o estudo desses adipócitos primários oferece algumas vantagens, também existem algumas limitações e preocupações que são impor…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Haruya Ohno, Kosaku Shinoda, Louis Sharp, Emi Tomoda, e Lauren Ruiz para discussão, ajuda técnica e assistência editorial no manuscrito. Este trabalho foi suportado por concessões do NIH (DK087853), do Programa de Pesquisa Biomédica e de ruptura de Asubio Pharm Inc. para SKULA foi apoiado por uma AÇÃO bolsas de doutoramento da Universidade de Copenhague e da UE FP7 projeto Diabat (SAÚDE-F2 -2.011-278373) Lise de Madsen e Kristiansen Karsten. Reconhecemos também o DERC centro de subvenção (NIH P30 DK063720).
Materials
| Reagent | |||
| Collaginase D | Roche | 11088874103 | |
| Dispase II | Roche | 04942078001 | |
| CaCl2 | |||
| DMEM medium | Fisher | 10017-CV | With 2,5 g/l glucose & L-glutamine without sodium pyruvate |
| Insulin | |||
| T3 (3,3′,5-Triiodo-L-thyronine) | Sigma | T-2877 | |
| Indomethacin | Sigma | I-7378 | |
| Dexamethasone | Sigma | D-1756 | |
| IBMX | Sigma | I-5879 | |
| Rosiglitazone | Sigma | R-2408 | |
| Equipment | |||
| Collagen coated dishes | BD | 354450 | 10 cm plates |
| 70 μm filter | BD Falcon | 352350 | Cell strainer,70 μm nylon 1/ea |
References
- Barness, L. A., Opitz, J. M., Gilbert-Barness, E. Obesity: genetic, molecular, and environmental aspects. American Journal of Medical Genetics. Part A. 143A, 3016-3034 (2007).
- Rothwell, N. J., Stock, M. J. Combined effects of cafeteria and tube-feeding on energy balance in the rat. The Proceedings of the Nutrition Society. 38, 5A (1979).
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiological Reviews. 84, 277-359 (2004).
- Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. The New England Journal of Medicine. 360, 1509-1517 (2009).
- van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. The New England Journal of Medicine. 360, 1500-1508 (2009).
- Virtanen, K. A., et al. Functional brown adipose tissue in healthy adults. The New England Journal of Medicine. 360, 1518-1525 (2009).
- Zingaretti, M. C., et al. The presence of UCP1 demonstrates that metabolically active adipose tissue in the neck of adult humans truly represents brown adipose tissue. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 23, 3113-3120 (2009).
- Saito, M., et al. High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity. Diabetes. 58, 1526-1531 (2009).
- Seale, P., et al. PRDM16 controls a brown fat/skeletal muscle switch. Nature. 454, 961-967 (2008).
- Petrovic, N., et al. Chronic peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma) activation of epididymally derived white adipocyte cultures reveals a population of thermogenically competent, UCP1-containing adipocytes molecularly distinct from classic brown adipocytes. The Journal of Biological Chemistry. 285, 7153-7164 (2010).
- Coulter, A. A., Bearden, C. M., Liu, X., Koza, R. A., Kozak, L. P. Dietary fat interacts with QTLs controlling induction of Pgc-1 alpha and Ucp1 during conversion of white to brown fat. Physiological Genomics. 14, 139-147 (2003).
- Klingenspor, M. Cold-induced recruitment of brown adipose tissue thermogenesis. Experimental Physiology. 88, 141-148 (2003).
- Cinti, S. The adipose organ. Prostaglandins, leukotrienes, and essential fatty acids. 73, 9-15 (1016).
- Ghorbani, M., Himms-Hagen, J. Appearance of brown adipocytes in white adipose tissue during CL 316,243-induced reversal of obesity and diabetes in Zucker fa/fa rats. International Journal of Obesity and Related Metabolic Disorders: Journal of the International Association for the Study of Obesity. 21, 465-475 (1997).
- Hansen, J. B., Kristiansen, K. Regulatory circuits controlling white versus brown adipocyte differentiation. The Biochemical Journal. 398, 153-168 (2006).
- Ohno, H., Shinoda, K., Spiegelman, B. M., Kajimura, S. PPARy agonists induce a white-to-brown fat conversion through stabilization of PRDM16 protein. Cell metabolism. 15, 395-404 (2012).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Mottillo, E. P., Granneman, J. G. In vivo identification of bipotential adipocyte progenitors recruited by beta3-adrenoceptor activation and high-fat feeding. Cell Metabolism. 15, 480-491 (2012).
- Cinti, S. Transdifferentiation properties of adipocytes in the adipose organ. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 297, E977-E986 (2009).
- Barbatelli, G., et al. The emergence of cold-induced brown adipocytes in mouse white fat depots is determined predominantly by white to brown adipocyte transdifferentiation. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 298, E1244-E1253 (2010).
- Petrovic, N., et al. Chronic peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma) activation of epididymally derived white adipocyte cultures reveals a population of thermogenically competent, UCP1-containing adipocytes molecularly distinct from classic brown adipocytes. The Journal of Biological Chemistry. 285, 7153-7164 (2009).
- Rong, J. X., et al. Adipose mitochondrial biogenesis is suppressed in db/db and high-fat diet-fed mice and improved by rosiglitazone. Diabetes. 56, 1751-1760 (2007).
- Wilson-Fritch, L., et al. Mitochondrial remodeling in adipose tissue associated with obesity and treatment with rosiglitazone. The Journal of Clinical Investigation. 114, 1281-1289 (2004).
- Sell, H., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonism increases the capacity for sympathetically mediated thermogenesis in lean and ob/ob mice. Endocrinology. 145, 3925-3934 (2004).
- Fukui, Y., Masui, S., Osada, S., Umesono, K., Motojima, K. A new thiazolidinedione, NC-2100, which is a weak PPAR-gamma activator, exhibits potent antidiabetic effects and induces uncoupling protein 1 in white adipose tissue of KKAy obese mice. Diabetes. 49, 759-767 (2000).
- Vernochet, C., et al. C/EBPalpha and the corepressors CtBP1 and CtBP2 regulate repression of select visceral white adipose genes during induction of the brown phenotype in white adipocytes by peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonists. Molecular and Cellular Biology. 29, 4714-4728 (2009).
- Tai, T. A., et al. Activation of the nuclear receptor peroxisome proliferator-activated receptor gamma promotes brown adipocyte differentiation. The Journal of Biological Chemistry. 271, 29909-29914 (1996).
- Sugii, S., et al. PPARgamma activation in adipocytes is sufficient for systemic insulin sensitization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 22504-22509 (2009).
