In-vitro-Kultur von Organoide Primäre Maus Kolontumoren
Summary
Eine einfache Methode zur primären murinen Kolontumor organoide etablieren beschrieben. Dieses Verfahren nutzt die Eigenschaft, dass Kolontumorzellen überleben und wachsen in Organoiden in Medien, die begrenzte Wachstumsfaktoren, während normale Kolonepithelzellen nicht tun.
Abstract
Mehrere Menschen und der Maus Darmkrebs-Zelllinien etabliert haben, sind physiologische Integrität Kolontumoren wie mehrere Zellschichten, Basal-apikale Polarität, die Fähigkeit, zu differenzieren und nicht in anoikis Darmkrebs abgeleiteten Zelllinien erhalten. Die vorliegende Studie zeigt, ein Verfahren zur Kultivierung von primären Maus Kolontumors organoids von Sato T et al. 1, die wichtige physiologische Funktionen Kolontumoren behält angepasst. Dieses Verfahren besteht aus Maus Colontumorgewebe Sammlung, neben normalen Kolonepithel Dissoziation Kolontumorzellen Verdauung in einzelne Zellen, die Einbettung Kolontumorzellen in Matrigel und selektive Kultur beruht auf dem Grundsatz, dass Tumorzellen das Wachstum auf limitierende Nährstoff Bedingungen gewährleisten im Vergleich zu normalen Epithelzellen.
Der Primärtumor Organoiden wenn aus genetisch veränderten Mäusen isoliert bieten einen sehr nützlichen System Tumor autonomen Funkt beurteilenIonen bestimmter Gene. Darüber hinaus sind die Tumor organoids zugänglich genetische Manipulation von Virus nachgedacht Gentransfer; daher Signalwege im Dickdarm Tumorentstehung beteiligt könnte auch weitgehend durch Überexpression oder Knockdown untersucht werden. Primärtumor Organoiden Kultur bietet eine physiologische relevant und machbar Mittel, um die Mechanismen und therapeutischen Modalitäten für Doppelpunkt Tumorentstehung zu untersuchen.
Introduction
Die intestinalen Epithelzellen vermehren und drehen auf einer außerordentlichen Geschwindigkeit und übertraf damit alle anderen Geweben im Körper Wirbeltier 2,3. Die teilenden Zellen, einschließlich Darm-Stammzellen (ISC) und Transit-Verstärkung Zellen differenzieren entweder in sekretorischen (Kelch, Paneth und enteroendokrinen) Zellen oder Enterozyten 3. Das ISC ist an der Basis der Krypta. Panethzellen nach unten auf den Boden des Krypten und sind langlebig, während andere Linien nach oben wandern, um den Darmzotten 3,4. Hier werden die Zellen in den Darm Inhalte einschließlich Mikroflora ausgesetzt und werden von den villus Tipps durch eine anoikis-induzierte Apoptose-Mechanismus zu vergießen. Obwohl die Doppelpunkt fehlt Zotten und Panethzellen, ist der Mechanismus für die Aufrechterhaltung der Homöostase ähnlich 4.
Der Wnt-Signalweg ist in eine entscheidende Rolle in der intestinalen Proliferation und ISC Wartung 4 gebracht worden. Löschung von the Transkriptionsfaktor TCF4, ein nachgeschalteter Effektor der Wnt-Signalweg, führt zum Verlust der intestinalen Stammzellen und die anschließende Aufteilung des Gewebes 5. Ebenso reduziert transgene Expression der Wnt-Inhibitor DKK1 die epithelialen Proliferation und erschöpft sekretorischen Zelllinien 6. Umgekehrt induziert die Überexpression des Wnt-Agonisten R-spondin-1 potente und rasche Verbreitung der intestinalen Kryptenzellen 7.
Angesichts der Bedeutung der Wnt-Signalweg für intestinale Homöostase, sind Wnt-Signalweg Mutationen häufig in Darmkrebs 8 beobachtet. Darmkrebs ist die dritthäufigste Todesursache durch Krebs in den Vereinigten Staaten 9. Excess Nahrungsaufnahme mit rotem Fleisch und Alkohol, Bewegungsmangel und geerbt und somatische Mutationen gelten als Risikofaktoren für Darmkrebs 10,11 sein. Die adenomatöse Polyposis coli (APC)-Gen, ein Schlüssel Wnt-Faktor ist in der Mehrzahl der pa mutiertenPatienten mit familiärer, sporadisch, und Colitis-assoziierten Darmkrebs 12,13. Mutationen von anderen Faktoren in Wnt-Signalweg einschließlich Axin2 und β-Catenin beteiligt sind auch bei Darmkrebs 14,15 beobachtet. Jedoch ist die genaue Mechanismus und wirksame Therapie für Darmkrebs noch aus. Um die Untersuchung der molekularen Mechanismen für Darmkrebs zu erleichtern, haben menschliche Darmkrebs-Zelllinien, die verschiedene Stufen der Tumorprogression von einer gutartigen zu einer aggressiven Zelltyp wurden 16-18 etabliert. Maus Kolonkarzinomzelllinien mit verschiedenen metastasierenden Eigenschaften sind auch 19,20. Dennoch sind Primärzellen oder organoide Kulturen über transformierten Zelllinien bevorzugt, weil sie genau imitieren die in vivo-Zustand und erzeugen mehr physiologisch relevanten Daten 21. Die meisten Dickdarm-Krebs-Zelllinien wachsen als Monolayer an der Platte befestigt oder als Zellsuspensionen lacking apikalen basolateralen Orientierung und Tight Junctions zwischen den Zellen. Außerdem unterziehen normalen und Tumor-intestinalen Epithelzellen in vivo eine spontane Form der Apoptose bezeichnet anoikis wie die differenzierten Zellen die villus Tipps erreichen und Schuppen 22. Diese Funktionen sind nur schwer in Zelllinien rekapitulieren, sind aber in den Entwicklungsprozess von Darmkrebs 23 wichtig. Diese Funktionen werden in primäre Organoiden gepflegt. Darüber hinaus bieten die Tumorzellen organoiden Kulturen ein wirksames System zur Tumor autonomen Funktion der Gene im Vergleich zu in-vivo-Studien zu beurteilen. Genetische Manipulation in vivo des Darms ist ein zeitaufwendiger Prozess vor allem durch die Schaffung von transgenen und / oder Knockout-Mäusen mit Darm-spezifischen Treibern. Allerdings sind die Tumor Organoiden leicht zugänglich, um virale vermittelte genetische Manipulationen und damit ein großes Werkzeug für die Beurteilung der genauen molekularen Mechanismen. Primäre Darmtumor organoide Kulturen have demonstriert worden, um eine praktikable und leistungsfähige Technik sein. Primäre Darm Zellkultur funktionelle Darm Organoiden mit Krypta-Darmzotten Struktur in vitro herzustellen aus einer einzigen Erwachsenen Lgr5 + Stammzellen 24. Diese Organoiden können transplantiert werden und eingepflanzt in ein beschädigtes Gewebe zur Regeneration Doppelpunkt 25. Weitere Anpassung der Kulturbedingungen hatte ähnliche epithelialen Organoiden von Maus Doppelpunkt und menschlichen Dünndarm und Dickdarm möglich 1 gemacht. Für primären normalen Kolonepithel Kultur, basale Kulturmedium sowie Wachstumsfaktoren, einschließlich EGF, Noggin, R-und spondin Wnt3a sind unerlässlich, während basale Kulturmedium und EGF ist ausreichend für wachsende primäre Maustaste Kolontumor Organoiden 1. Hier beschreiben wir ein ausführliches Protokoll zu isolieren, Kultur und erzeugen Kolontumor Organoiden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die experimentellen Verfahren in diesem Protokoll beschrieben wird zur Isolierung und Kultivierung von primären murinen Kolontumoren ermöglichen. Das Protokoll wird von bahnbrechenden Arbeit von Dr. Clevers Gruppe 1,24,27 getan angepasst. Wir optimierten die Verdauung Zeit und Kollagenasekonzentration um eine bessere Ausbeute des Tumors Organoiden bekommen. Die kritischen Schritte umfassen Tumorzelle Verdauung in einzelne Zellen, Matrigel Resuspension und selektive Kultur. Für Tumorzellen Verdauung, um ein…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschüsse zu YMS von den National Institutes of Health (CA148828), The University of Michigan Gastrointestinale Peptide Center und Jeffrey A. Colby Colon Cancer Research und der Tom Liu Memorial Funds von der University of Michigan Comprehensive Cancer Center unterstützt.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | BD Biosciences | 356234 | 5 mg/ml |
| Collagenase Type IV | Worthington | LS004188 | 375 U/mg |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | 1.8 U/mg |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634010 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF), Murine, Natural | Invitrogen | 53003-018 | |
| N2 Supplement | Invitrogen | 17502-048 | 100 x |
| B27 Supplement | Invitrogen | 17504-044 | 50 x |
| Glutamax-I | Gibco | 35050-079 | 100x |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165-5G | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Invitrogen | 11965-092 | |
| PicoPureTM RNA Isolation Kit | Invitrogen | KIT0204 |
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