Meting van vacuolaire pH en Cytosolic<em> In Vivo</em> In de gistcel Schorsingen

Summary

Vacuolaire en cytosolische pH kan worden gemeten in levende gist (<em> S. cerevisiae</em>) Cellen middels ratiometrisch fluorescente kleurstoffen gelokaliseerd in specifieke cellulaire compartimenten. We beschrijven de procedures voor het meten van pH van de vacuole met BCECF-AM, die lokaliseert aan de vacuole in gist, en cytosolische pH met een cytosolisch ratiometrische pH-gevoelige GFP (gist pHluorin).

Abstract

Vacuolaire en cytosolische pH zijn sterk gereguleerd in gistcellen en nemen een centrale rol in de totale pH homeostase. We beschrijven ratiometric protocollen voor het meten van pH in vivo middels pH-gevoelige fluoroforen gelokaliseerd in de vacuole of cytosol. Vacuolaire pH wordt gemeten met BCECF die lokaliseert de vacuole in gist als in cellen geïntroduceerd in de acetoxymethylester vorm. Cytosolische pH wordt gemeten met een pH-gevoelige GFP expressie onder controle van een gist promoter, gist pHluorin. Werkwijzen voor het meten van fluorescentie ratio in gist celsuspensies in een fluorimeter worden beschreven. Door middel van deze protocollen, hebben enkel tijdstip van de pH onder verschillende omstandigheden of in verschillende gist mutanten werden vergeleken en veranderingen in de pH in de tijd zijn gemonitord. Deze werkwijzen zijn ook aangepast om een ​​fluorescentie plaatlezer format voor high-throughput experimenten. Voordelen van ratiometrisch pH-metingen ten opzichte van andere apbenaderingen die momenteel in gebruik, mogelijke experimentele problemen en oplossingen, en de vooruitzichten voor het toekomstige gebruik van deze technieken worden ook beschreven.

Introduction

pH homeostase is een dynamisch en sterk gereguleerd proces in alle organismen ^1,2. Biochemische processen zijn strak gereguleerd door de pH, en intracellulaire omgevingen zijn afgestemd op smalle pH varieert om een ​​optimale werking van de bewoner enzymen toestaan. Echter, kan intracellulaire pH homeostase worden aangevochten door snelle veranderingen in het milieu pH, metabole verschuivingen, en bepaalde signaalwegen. Bovendien intracellulaire pH kan zichzelf dienen als een belangrijk signaal. Tenslotte vele organellen handhaven luminale pH waarden verschillen van het omringende cytosol en essentieel voor organel-specifieke functies.

De gist Saccharomyces cerevisiae deelt een aantal pH homeostase mechanismen met hogere eukaryoten ^2. In de zure organellen van de endocytische / lysosomale route, wordt de pH in de eerste plaats bepaald door de sterk geconserveerde vacuole proton-translocerende ATPase (v-ATPase), handelend in combinatie met vele exchangers afhankelijk van de pH gradiënt. Alle eukaryote cellen hebben ook proton export mechanismen. In schimmels en planten, een tweede, afzonderlijke protonpompremmers bij de plasmamembraan, Pma1, export metabole protonen en wordt beschouwd als de belangrijkste determinant van cytosolische pH en plasmamembraan potentie. De genetische flexibiliteit van S. cerevisiae en haar commerciële belang, hebben het tot een zeer interessant en belangrijk model voor het bestuderen van pH homeostase ² gemaakt.

Naast de primaire bestuurders van organellen verzuring zijn V-ATPases sterk gereguleerde enzymen en ons lab is geïnteresseerd in het begrip van mechanismen van V-ATPase regulering. Naar dit doel, hebben we met behulp van in vivo pH-metingen van de vacuole en cytosolische pH: 1) om reacties op veranderende extracellulaire omstandigheden, zoals glucose deprivatie en readdition, 2) monitoren van de effecten van mutaties die compromissen V-ATPase activiteit te onderzoeken, en 3) aan de coör verkennencoördinatie van organel en plasmamembraan protonpompen ^3-5. Deze experimenten werd pas mogelijk door de ontwikkeling van robuuste ratiometrisch pH indicatoren vatbaar voor gebruik in gistcellen. . Plant et al. toonde aan dat eerste BCECF (2'7'-bis-(2-carboxyethyl) -5 – (en 6)-carboxyfluoresceïne), die veelvuldig gebruikt cytosolische pH in zoogdiercellen meten, accumuleert in de gist vacuole in plaats van het cytosol ^6. Dit verschil in lokalisatie BCECF wordt toegeschreven aan de vele hydrolytische enzymen in de vacuole, die waarschijnlijk verantwoordelijk voor splitsing van de acetoxy methylester van BCECF-AM (acetoxymethylester van BCECF) en vacuolaire retentie ^6. Ali et al.. ⁷ verder ontwikkeld pH van de vacuole meting met BCECF en aangepast deze metingen naar een fluorescentieplaatlezer formaat. Brett et al.. PHluorin gist geïntroduceerd als een middel voor het meten cytosolische pH in gist door een expressie plasmide gedragen ratiometric pH-gevoelige GFP ⁸ onder controle van een gist-specifieke promoter ^9.

De excitatie spectra van zowel BCECF en gist pHluorin zijn gevoelig voor pH, zodat ze worden gebruikt als ratiometric pH indicatoren waarin de verhouding van fluorescentie bij twee golflengten, gemeten bij een emissiegolflengte, verschaft een maat van pH ^8,10. Deze gist vacuole en cytosolische pH-sensoren zijn gebruikt voor zowel single-cell en de bevolking op basis van metingen. Single-cell metingen ^6,11 worden uitgevoerd door fluorescentie microscopie en beeldanalyse. Vacuolaire of cytosolische fluorescentie bij de twee golflengten wordt gemeten voor elke cel. De bevolking op basis van metingen worden uitgevoerd in een van beide een microplaataflezer met geschikte fluorescentie-mogelijkheden of in een fluorimeter. We hebben over het algemeen gedaan onze metingen in een fluorimeter, want het biedt gemakkelijke toegang voor toevoeging van componenten, zoals glucose tijdens concontinue kinetische metingen. Onze huidige lab protocollen voor het meten van de vacuole en cytosolische pH zijn hieronder vermeld, beide zijn ook gemakkelijk aangepast aan microplate assays.

Protocol

1. Meting van vacuolaire pH in vivo gebruik BCECF-AM Kweek een 50 ml vloeibare kweek van de giststam te meten in het gewenste medium overnight. Het doel is om cellen te hebben in mid-log fase (OD600 (optische dichtheid bij 600 nm) gemeten van ongeveer 0,8 voor de ophanging). Pellet de gistcellen door centrifugeren. Resuspendeer de pellet in 0,6 ml groeimedium en transfer naar een microcentrifugebuis die eerder gewogen. Pellet de cellen opnieuw in een microcentrifuge bij 2000 xg gedurende 60…

Representative Results

Figuur 1 geeft pH van de vacuole gegevens verkregen over wild-type gistcellen gekweekt in rijk medium (gistextract-pepton-dextran; YEPD) gebufferd op pH 5 met 50 mM MES. We bieden meestal de cellen in gebufferd medium omdat de pH van het medium kan vrij dramatisch veranderen tijdens groei gedurende de nacht, in het bijzonder voor minimaal medium, en we hebben gevonden dat de pH van het groeimedium kunnen beïnvloeden vacuolaire pH reacties 3. Maar het is ook voor veel experimenten de cellen g…

Discussion

We hebben deze protocollen gebruikt om enkele aspecten van pH homeostase pakken. Zo hebben we cytosolische en pH reacties van wild-type en v-ATPase-deficiënte mutantcellen ^4,5 vergeleken. We hebben ook de effecten van veranderde groeiomstandigheden bijzonder extracellulaire pH op vacuolaire pH reactie op glucose ³ onderzocht. Belangrijk is dat de reacties die we waarnemen zijn beide consistent met andere methoden van kwantitatief pH-meting en biochemische data beschrijven gewijzigde activiteiten v…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Spectrofluorometer	Horiba Jobin Yvon	Model Fluoromax-4	Temperature control and stirring capability are desirable.
BCECF-AM	Invitrogen/Molecular Probes	B1150	Prepare a 12 mM stock in dry DMSO, store as aliquots at -20 °C
monensin	Sigma	M5273	Toxic.
nigericin	Sigma	N7143	Toxic.
MES	Sigma	M8250