Измерение и вакуолярных Цитозольные рН<em> In Vivo</em> В суспензиях Дрожжи клеточной
Summary
Вакуоли и цитозольных рН может быть измерена в живых дрожжей (<em> С. CEREVISIAE</em>) При использовании логометрического флуоресцентных красителей локализованы в конкретных клеточных компартментах. Опишем процедуры измерения рН вакуоли с BCECF-AM, который локализуется в вакуоль у дрожжей и цитозольных рН с цитозольного логометрических рН-чувствительных GFP (дрожжи pHluorin).
Abstract
Вакуоли и цитозольных рН строго регулируется в клетках дрожжей и занимают центральную роль в гомеостазе общий рН. Мы описываем протоколы для радиометрические измерения рН в естественных условиях использования рН-чувствительных флуорофорам локализован в вакуоль или цитозоль. Вакуоли рН измеряли с использованием BCECF, который локализуется в вакуоль в дрожжах при введении в клетки в ацетоксиметил форме сложного эфира. Цитозольного рН измеряли с помощью рН-чувствительных GFP экспрессировался под контролем промотора, дрожжи, дрожжевой pHluorin. Методы измерения флуоресценции соотношений в дрожжевой клетке суспензий на флуориметре описаны. С помощью этих протоколов, один момент времени измерения рН в разных условиях и в разных мутантов дрожжей сравнением и изменения рН в течение долгого времени был проведен мониторинг. Эти методы также были адаптированы к флуоресцентным планшет-ридере формат высокой пропускной экспериментов. Преимущества радиометрические измерения рН по сравнению с другими APподходы используются в настоящее время, потенциальные экспериментальные проблемы и решения, а также перспективы для будущего использования этих методов также описаны.
Introduction
рН гомеостаза является динамичной и строго регулируется процесс во всех 1,2 организмов. Биохимические процессы жестко регулируется рН и внутриклеточной среды настроены на узких диапазонах рН для оптимальной деятельности резидента ферментов. Однако гомеостаз внутриклеточного рН может быть оспорена быстрых изменений в рН среды, метаболические сдвиги, и определенные сигнальные пути. Кроме того, внутриклеточный рН сам по себе может служить в качестве важного сигнала. Наконец, многие органеллы поддержания просвета значениях рН, которые отличаются от окружающих цитозоль и необходимым для органелл конкретных функций.
Дрожжей Saccharomyces CEREVISIAE акций ряда рН гомеостаза механизмов высших эукариот 2. В кислой органелл эндоцитические / лизосомальных пути, рН главным образом управляется высоко консервативны вакуоли протон-АТФазы транслокации (V-АТФазы), действующее совместно с многими валеюрт зависит от рН градиента. Все эукариотической клетки также имеют механизмы протонной экспорт. В грибов и растений, второй, отличный протонного насоса в плазматической мембране, Pma1, экспорт метаболический протонов и, как полагают, основным фактором, определяющим цитозольного рН и потенциала плазматической мембране. Генетической гибкости С. CEREVISIAE и его коммерческой важности, сделали его очень интересной и важной моделью для изучения рН гомеостаза 2.
Помимо того, что главной движущей силой в подкисления органелл, V-АТФазы строго регулируется ферментами и наша лаборатория заинтересован в понимании механизмов V-АТФазы регулирования. Для достижения этой цели мы используем в естественных условиях измерения рН и вакуолярных цитозольные рН: 1) для контроля реакции на меняющийся внеклеточной условия, такие как глюкоза и лишения readdition, 2) для изучения влияния мутаций, что компромисс V-АТФазы, и 3) изучить координатахдинация органелл и плазматической мембраной протонного насоса 3-5. Эти эксперименты только стало возможным благодаря разработке надежных радиометрические показатели рН поддается использовать в клетках дрожжей. . Растений и др. впервые показали, что BCECF (2'7'-бис-(2-карбоксиэтил) -5 – (и 6)-карбоксифлуоресцеина), который широко используется для измерения цитозольного рН в клетках млекопитающих, накапливается в дрожжевой вакуоль вместо цитозоле 6. Это различие в локализации BCECF было обусловлено многими гидролитических ферментов в вакуоль, которые, вероятно, ответственных за отщеплению ацетокси-метиловый эфир из BCECF-AM (ацетоксиметил эфира BCECF) и вакуоли удержания 6. Али и др.. 7 дальнейшее развитие вакуолярных измерения рН с использованием BCECF и адаптировать этих измерений флуоресценции формате ридере. Brett соавт. Введены дрожжи pHluorin в качестве средства измерения цитозольного рН в дрожжах путем экспрессии плазмиды Гatiometric рН-чувствительных 8 GFP под контролем дрожжевого промотора 9.
Спектры возбуждения и BCECF и дрожжей pHluorin чувствительные к рН, поэтому они используются в качестве логометрических показатели рН, в которой отношение флуоресценции при возбуждении двух длинах волн, измеренные при одной длине волны излучения, обеспечивает измерение рН 8,10. Эти дрожжи вакуолярных и цитозольные датчики рН были использованы как для одноклеточных и популяционном уровнях измерений. Одноклеточные измерений 6,11 выполняются с помощью флуоресцентной микроскопии и анализа изображений. Вакуоли или цитозольных флуоресценции при двух длинах волн измеряют для каждой ячейки. Населения на основе измерения выполняются в любом планшетного флуоресценции с соответствующими возможностями или в флуориметра. В целом, мы сделали наши измерения на флуориметре, потому что она обеспечивает легкий доступ для добавления компонентов, таких как глюкоза во Conнепрерывный кинетических измерений. Наши текущие протоколы лаборатории для измерения и вакуолярных цитозольные рН перечислены ниже, оба они являются также легко адаптируется к микропланшет анализов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы использовали эти протоколы для решения ряда аспектов рН гомеостаза. Например, мы сравнивали цитозольного и рН реакции дикого типа и V-АТФазы с дефицитом мутантных клеток 4,5. Мы также исследовали влияние изменившихся условий роста, в частности рН внеклеточной, на вакуолярных от?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана NIH R01 GM50322 в PM Кейна. Авторы благодарят доктора Раджини Рао, Университет Джона Хопкинса за предоставление дрожжей pHluorin плазмид и для рекомендаций по радиометрические измерения рН, и д-р Глория А. Мартинес Муньос для разработки этих протоколов для нашей лаборатории.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Spectrofluorometer | Horiba Jobin Yvon | Model Fluoromax-4 | Temperature control and stirring capability are desirable. |
| BCECF-AM | Invitrogen/Molecular Probes | B1150 | Prepare a 12 mM stock in dry DMSO, store as aliquots at -20 °C |
| monensin | Sigma | M5273 | Toxic. |
| nigericin | Sigma | N7143 | Toxic. |
| MES | Sigma | M8250 |
References
- Casey, J. R., Grinstein, S., Orlowski, J. Sensors and regulators of intracellular pH. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 50-61 (2010).
- Orij, R., Brul, S., Smits, G. J. Intracellular pH is a tightly controlled signal in yeast. Biochim. Biophys. Acta. 1810, 933-944 (2011).
- Diakov, T. T., Kane, P. M. Regulation of vacuolar proton-translocating ATPase activity and assembly by extracellular pH. J. Biol. Chem. 285, 23771-23778 (2010).
- Martinez-Munoz, G. A., Kane, P. Vacuolar and plasma membrane proton pumps collaborate to achieve cytosolic pH homeostasis in yeast. J. Biol. Chem. 283, 20309-20319 (2008).
- Tarsio, M., Zheng, H., Smardon, A. M., Martinez-Munoz, G. A., Kane, P. M. Consequences of loss of Vph1 protein-containing vacuolar ATPases (V-ATPases) for overall cellular pH homeostasis. J. Biol. Chem. 286, 28089-28096 (2011).
- Plant, P. J., Manolson, M. F., Grinstein, S., Demaurex, N. Alternative mechanisms of vacuolar acidification in H(+)-ATPase-deficient yeast. J. Biol. Chem. 274, 37270-37279 (1999).
- Ali, R., Brett, C. L., Mukherjee, S., Rao, R. Inhibition of sodium/proton exchange by a Rab-GTPase-activating protein regulates endosomal traffic in yeast. J. Biol. Chem. 279, 4498-4506 (2004).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Brett, C. L., Tukaye, D. N., Mukherjee, S., Rao, R. The yeast endosomal Na+K+/H+ exchanger Nhx1 regulates cellular pH to control vesicle trafficking. Mol. Biol. Cell. 16, 1396-1405 (2005).
- Owen, C. S. Comparison of spectrum-shifting intracellular pH probes 5′(and 6′)-carboxy-10-dimethylamino-3-hydroxyspiro[7H-benzo[c]xanthene-7, 1′(3’H)-isobenzofuran]-3′-one and 2′,7′-biscarboxyethyl-5(and 6)-carboxyfluorescein. Anal. Biochem. 204, 65-71 (1992).
- Dechant, R., et al. Cytosolic pH is a second messenger for glucose and regulates the PKA pathway through V-ATPase. Embo J. 29, 2515-2526 (2010).
- Gustavsson, M., Barmark, G., Larsson, J., Muren, E., Ronne, H. Functional genomics of monensin sensitivity in yeast: implications for post-Golgi traffic and vacuolar H+-ATPase function. Mol. Genet. Genomics. 280, 233-248 (2008).
- Kovac, L., Bohmerova, E., Butko, P. Ionophores and intact cells. I. Valinomycin and nigericin act preferentially on mitochondria and not on the plasma membrane of Saccharomyces cerevisiae. Biochim. Biophys. Acta. 721, 341-348 (1982).
- Braun, N. A., Morgan, B., Dick, T. P., Schwappach, B. The yeast CLC protein counteracts vesicular acidification during iron starvation. J. Cell Sci. 123, 2342-2350 (2010).
- Orij, R., Postmus, J., Beek, T. e. r., Brul, A., S, G. J., Smits, In vivo measurement of cytosolic and mitochondrial pH using a pH-sensitive GFP derivative in Saccharomyces cerevisiae reveals a relation between intracellular pH and growth. Microbiology. 155, 268-278 (2009).
- Zhang, Y. Q., et al. Requirement for ergosterol in V-ATPase function underlies antifungal activity of azole drugs. PLoS Pathog. 6, e1000939 (2010).
- Brett, C. L., et al. Genome-wide analysis reveals the vacuolar pH-stat of Saccharomyces cerevisiae. PLoS One. 6, e17619 (2011).
- Roberts, C. J., Raymond, C. K., Yamashiro, C. T., Stevens, T. H. Methods for studying the yeast vacuole. Methods Enzymol. 194, 644-661 (1991).
- Chan, C. Y., et al. Inhibitors of V-ATPase proton transport reveal uncoupling functions of tether linking cytosolic and membrane domains of V0 subunit a (Vph1p). J. Biol. Chem. 287, 10236-10250 (2012).
- Johnson, R. M., et al. Identification of inhibitors of vacuolar proton-translocating ATPase pumps in yeast by high-throughput screening flow cytometry. Anal. Biochem. 398, 203-211 (2010).
