מדידה של pH vacuolar וCytosolic<em> In Vivo</em> בהשעיות תא שמרים
Summary
pH vacuolar וcytosolic ניתן למדוד בשמרי חיים (<em> ס cerevisiae</em>) תאים באמצעות צבעי ניאון ratiometric המקומיים לתאים סלולריים מסוימים. אנו מתארים נהלים למדידת חומציות vacuolar עם BCECF-AM, שlocalizes לvacuole בשמרים, וה-pH cytosolic עם GFP pH רגיש ratiometric cytosolic (שמרי pHluorin).
Abstract
Vacuolar וcytosolic pH הם מאוד מוסדר בתאי שמרים ותופס תפקיד מרכזי באיזון חומציות בכללותה. אנו מתארים פרוטוקולים למדידת ratiometric של pH in vivo באמצעות pH רגיש fluorophores המקומי לvacuole או cytosol. pH vacuolar נמדד באמצעות BCECF, שlocalizes לvacuole בשמרים כאשר הוכנסו לתאים בצורת אסתר acetoxymethyl שלה. pH cytosolic נמדד עם GFP pH רגיש הביע תחת שליטה של אמרגן שמרים, שמרי pHluorin. שיטות למדידת יחס הקרינה בהשעיות תא שמרים בfluorimeter מתוארות. באמצעות פרוטוקולים אלה, מדידות נקודת זמן יחידה של ה-pH בתנאים שונים או בשמרי מוטנטים שונים כבר השוואה ושינויים ב-pH לאורך הזמן היו במעקב. שיטות אלה גם הותאמו לפורמט קורא צלחת הקרינה לניסויי תפוקה גבוהה. יתרונות של מדידות pH ratiometric מעל AP האחרproaches כיום בשימוש, בעיות פוטנציאליות ניסיוניות ופתרונות, וסיכויים לשימוש עתידי של טכניקות אלה גם תאר.
Introduction
הומאוסטזיס pH הוא תהליך דינמי ופיקוח הדוק בכל 1,2 אורגניזמים. תהליכים ביוכימיים מוסדרים היטב על ידי חומציות, וסביבות תאיות מכוונים לטווחי pH צרים כדי לאפשר פעילות אופטימלית של אנזימי התושב. עם זאת, ניתן יהיה לערער על הומאוסטזיס pH תאי על ידי שינויים מהירים בחומציות סביבתית, משמרות מטבוליים, ומסלולי איתות מסוימים. בנוסף, ה-pH תאי יכול עצמו לשמש כאות חשובה. לבסוף, אברונים רבים לשמור על ערכי pH lumenal הנבדלים מסביבת cytosol וחיוניים לתפקודי אברון ספציפיים.
מניות cerevisiae Saccharomyces שמרי מספר מנגנוני הומאוסטזיס pH עם אאוקריוטים גבוהים יותר 2. באברונים חומציים של מסלול endocytic / lysosomal, pH נשלט בעיקר על ידי vacuolar פרוטון translocating-ATPase השמור ביותר (V-ATPase), הפועל במקביל עם רבים exchanGers תלויה בשיפוע PH. כל התאים אוקריוטים גם מנגנוני יצוא פרוטון. הוא האמינו בפטריות וצמחים, משאבת מימן שנייה, ברורה בקרום הפלזמה, Pma1, פרוטונים מטבוליות יצוא ולהיות הקובע העיקרי של ה-pH cytosolic ופוטנציאל קרום פלזמה. הגמישות הגנטית של ס ' cerevisiae והחשיבות המסחרית שלה, הפכו אותו למודל מאוד מעניין וחשוב ללימוד pH הומאוסטזיס 2.
בנוסף להיותו מניעים העיקריים של החמצת אברון, V-ATPases מאוד מוסדר אנזימים והמעבדה שלנו היא מעוניינת בהבנת מנגנוני ויסות V-ATPase. למען מטרה זו, יש לנו כבר משתמשים במדידות pH vivo של pH vacuolar וcytosolic: 1) לעקוב אחר תגובות לתנאים תאיים משתנים, כגון גלוקוז וקיפוח readdition, 2) כדי לבחון את ההשפעות של מוטציות שפשרת פעילות V-ATPase, ו 3) לחקור coordination של אברון ופלזמת משאבות פרוטונים בממברנה 3-5. ניסויים אלה התאפשרו רק באמצעות הפיתוח של אינדיקטורים pH ratiometric חזקים המתאימים לשימוש בתאי שמרים. . צמח ואח' הראשון הראה כי BCECF (2'7'-Bis (2-carboxyethyl) -5 – (ו 6), carboxyfluorescein), שכבר בשימוש נרחב למדידת חומציות cytosolic בתאי יונקים, מצטבר בvacuole השמרים במקום 6 cytosol. הבדל זה בלוקליזציה BCECF יוחס לאנזימים הרבים hydrolytic בvacuole, אשר עשוי אחראים למחשוף של תיל אסטר acetoxy מBCECF-AM (אסתר acetoxymethyl של BCECF) וvacuolar שימור 6. עלי ואח'. 7 מפותח יותר מדידת חומציות vacuolar באמצעות BCECF ומותאם מדידות אלה לפורמט קורא צלחת פלואורסצנטי. ברט ואח'. הציג pHluorin שמרים כאמצעי למדידת חומציות cytosolic בשמרים בהבעת R פלסמיד שמקורןGFP atiometric pH רגיש 8 תחת שליטה של אמרגן שמרים ספציפי 9.
ספקטרום העירור של שני BCECF ושמרי pHluorin רגיש לחומציות, ולכן הם משמשים כאינדיקטורים pH ratiometric שבה היחס של הקרינה בשני אורכי גל עירור, הנמדדים באורך גל פליטה יחידה, מספק מדד לרמת חומציות 8,10. חיישני pH vacuolar וcytosolic אלה שמרים שמשו במשך שתי מדידות התא בודדות ומבוססות אוכלוסייה. מדידות תא בודד 6,11 מבוצעות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי וניתוח תמונה. הקרינה vacuolar או cytosolic בשני אורכי הגל נמדדת לכל תא. המדידות מבוססות אוכלוסייה מבוצעות בשני קורא microplate עם יכולות הקרינה מתאימות או בfluorimeter. בדרך כלל יש לנו לעשות מדידות שלנו בfluorimeter, משום שהיא מספקת גישה קלה לתוספת של רכיבים כגון גלוקוז בקוןמדידות הקינטית tinuous. פרוטוקולי המעבדה הנוכחיים שלנו למדידת חומציות vacuolar וcytosolic מפורטים להלן; הן מותאמים גם למבחנים בקלות microplate.
Protocol
Representative Results
Discussion
יש לנו פרוטוקולים אלה מנוצלים כדי לטפל במספר היבטים של הומאוסטזיס-pH. לדוגמה, יש לנו לעומת תגובות cytosolic וה-pH של תאים שעברו מוטציה ופראי מסוג V-ATPase לקוי 4,5. גם אנחנו בדקנו את ההשפעות של תנאים שהשתנו צמיחה, במיוחד pH תאי, בתגובה לגלוקוז vacuolar pH 3. חשוב מכך, את התגובו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי NIH R01 GM50322 לPM קיין. המחברים מודים לד"ר ראג'יני ראו, אוניברסיטת ג'ונס הופקינס למתן פלסמידים pHluorin שמרים ועצה על מדידות pH ratiometric, וד"ר א 'גלוריה מרטינז מוניוס לעבודה מתוך פרוטוקולים אלה למעבדה שלנו.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Spectrofluorometer | Horiba Jobin Yvon | Model Fluoromax-4 | Temperature control and stirring capability are desirable. |
| BCECF-AM | Invitrogen/Molecular Probes | B1150 | Prepare a 12 mM stock in dry DMSO, store as aliquots at -20 °C |
| monensin | Sigma | M5273 | Toxic. |
| nigericin | Sigma | N7143 | Toxic. |
| MES | Sigma | M8250 |
References
- Casey, J. R., Grinstein, S., Orlowski, J. Sensors and regulators of intracellular pH. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 50-61 (2010).
- Orij, R., Brul, S., Smits, G. J. Intracellular pH is a tightly controlled signal in yeast. Biochim. Biophys. Acta. 1810, 933-944 (2011).
- Diakov, T. T., Kane, P. M. Regulation of vacuolar proton-translocating ATPase activity and assembly by extracellular pH. J. Biol. Chem. 285, 23771-23778 (2010).
- Martinez-Munoz, G. A., Kane, P. Vacuolar and plasma membrane proton pumps collaborate to achieve cytosolic pH homeostasis in yeast. J. Biol. Chem. 283, 20309-20319 (2008).
- Tarsio, M., Zheng, H., Smardon, A. M., Martinez-Munoz, G. A., Kane, P. M. Consequences of loss of Vph1 protein-containing vacuolar ATPases (V-ATPases) for overall cellular pH homeostasis. J. Biol. Chem. 286, 28089-28096 (2011).
- Plant, P. J., Manolson, M. F., Grinstein, S., Demaurex, N. Alternative mechanisms of vacuolar acidification in H(+)-ATPase-deficient yeast. J. Biol. Chem. 274, 37270-37279 (1999).
- Ali, R., Brett, C. L., Mukherjee, S., Rao, R. Inhibition of sodium/proton exchange by a Rab-GTPase-activating protein regulates endosomal traffic in yeast. J. Biol. Chem. 279, 4498-4506 (2004).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Brett, C. L., Tukaye, D. N., Mukherjee, S., Rao, R. The yeast endosomal Na+K+/H+ exchanger Nhx1 regulates cellular pH to control vesicle trafficking. Mol. Biol. Cell. 16, 1396-1405 (2005).
- Owen, C. S. Comparison of spectrum-shifting intracellular pH probes 5′(and 6′)-carboxy-10-dimethylamino-3-hydroxyspiro[7H-benzo[c]xanthene-7, 1′(3’H)-isobenzofuran]-3′-one and 2′,7′-biscarboxyethyl-5(and 6)-carboxyfluorescein. Anal. Biochem. 204, 65-71 (1992).
- Dechant, R., et al. Cytosolic pH is a second messenger for glucose and regulates the PKA pathway through V-ATPase. Embo J. 29, 2515-2526 (2010).
- Gustavsson, M., Barmark, G., Larsson, J., Muren, E., Ronne, H. Functional genomics of monensin sensitivity in yeast: implications for post-Golgi traffic and vacuolar H+-ATPase function. Mol. Genet. Genomics. 280, 233-248 (2008).
- Kovac, L., Bohmerova, E., Butko, P. Ionophores and intact cells. I. Valinomycin and nigericin act preferentially on mitochondria and not on the plasma membrane of Saccharomyces cerevisiae. Biochim. Biophys. Acta. 721, 341-348 (1982).
- Braun, N. A., Morgan, B., Dick, T. P., Schwappach, B. The yeast CLC protein counteracts vesicular acidification during iron starvation. J. Cell Sci. 123, 2342-2350 (2010).
- Orij, R., Postmus, J., Beek, T. e. r., Brul, A., S, G. J., Smits, In vivo measurement of cytosolic and mitochondrial pH using a pH-sensitive GFP derivative in Saccharomyces cerevisiae reveals a relation between intracellular pH and growth. Microbiology. 155, 268-278 (2009).
- Zhang, Y. Q., et al. Requirement for ergosterol in V-ATPase function underlies antifungal activity of azole drugs. PLoS Pathog. 6, e1000939 (2010).
- Brett, C. L., et al. Genome-wide analysis reveals the vacuolar pH-stat of Saccharomyces cerevisiae. PLoS One. 6, e17619 (2011).
- Roberts, C. J., Raymond, C. K., Yamashiro, C. T., Stevens, T. H. Methods for studying the yeast vacuole. Methods Enzymol. 194, 644-661 (1991).
- Chan, C. Y., et al. Inhibitors of V-ATPase proton transport reveal uncoupling functions of tether linking cytosolic and membrane domains of V0 subunit a (Vph1p). J. Biol. Chem. 287, 10236-10250 (2012).
- Johnson, R. M., et al. Identification of inhibitors of vacuolar proton-translocating ATPase pumps in yeast by high-throughput screening flow cytometry. Anal. Biochem. 398, 203-211 (2010).
