原虫でプライミング細菌で扱いやすい哺乳動物細胞感染
Summary
この手法は、収穫する方法を提供するものであり、哺乳動物細胞の感染に先立って自然原虫の宿主細胞にあらかじめ栽培されている細菌性病原体の細胞内増殖を正常化し、定量化する。このメソッドは、プライミング段階のための宿主細胞、ならびに標的細胞の種類の多種多様に対応するように変更することができます。
Abstract
多くの細胞内細菌の病原体は、環境中で増殖のための自然宿主として淡水原生動物を使用するレジオネラ·ニューモフィラ 、レジオネラ肺炎の病原体は、第1の従来哺乳類のマクロファージの感染原虫の細胞から採取し体外培養細菌の過病原性の利点を得る。このことは重要な病原因子が適切にin vitroで発現されないことを示唆している。我々は、プライミングLの扱いやすいシステムを開発した哺乳動物細胞に感染し、その自然宿主原虫カステラーニアメーバを通じてpneumophilaの前。任意の病原因子の寄与は原虫プライミング後に野生型細菌に変異株の細胞内増殖を比較することによって調べることができます。 GFPを発現する野生型と変異型のL. pneumophilaの株はプライミング工程で単層原虫を感染させるために使用され、細胞内増殖の後期段階に到達するために許可されている。蛍光細菌は、これらの感染細胞から採取し、哺乳類のマクロファージへのその後の感染の細菌の匹敵する数値を生成する分光光度法によって正規化されています。定量では、生きた細菌を蛍光顕微鏡、フローサイトメトリー、およびコロニーめっきによりを用いて感染後に監視されています。この手法は、強調表示され、天然の取得経路で遭遇するであろう環境を模倣することにより、宿主細胞依存性遺伝子発現の寄与に依存しています。このアプローチは、病原性の優位性を得るための手段として、中間宿主を使用するすべての細菌に対応するように変更することができます。
Introduction
多数の細菌性病原体は、細胞内コンパートメントの生存と複製のための宿主細胞を悪用するための一般的な戦略を適応している。多くの例では、病原性のメカニズムは原生動物と後生動物の細胞との間の類似している。ただし、これら二つの微小環境は非常に異なっていると1-4毒性因子の発現差異をもたらすことができます。レジオネラ症細菌レジオネラは遍在5世界中の淡水環境に関連付けられています。重要なのは、L.原生動物の細胞を出細菌のその全体的な遺伝子発現プロファイルを示唆して、病原性の優位性を得るヒト単球の感染前に原生動物細胞で栽培pneumophilaのは、生物6-8栽培におけるin vitroのそれよりも異なっている。自然界では、淡水のアメーバは、侵入細菌の迅速増幅のための栄養豊富な範囲を提供します。 Lの人間買収pneumophILAは、ほとんどの場合、細菌が含まれている汚染された水滴の吸入に起因すると考えられる。それは、これらの液滴港原虫細胞関連細菌がいる可能性があり、原生動物の細胞は9,10従来の水処理慣行に対してより耐性がある場所。 11月13日原虫の宿主細胞における細菌の細胞内のライフサイクルとほぼ同じ方法で、肺胞マクロファージが進むの感染。
生き残るためには、真核細胞内で複製するために、L.レジオネラは、宿主細胞の細胞質に14から16まで約300の"エフェクター"タンパク質を提供するドット/ ICMと呼ばれる特殊なタイプのIVbの分泌系を使用しています。これらのエフェクタータンパク質を総称細菌17,18のレプリケーション寛容なコンパートメントを生成するために、細胞プロセスを打倒するために機能する。細胞内MULTための欠損株でドット/ ICMトランスポーター結果を構成する26の遺伝子のいずれかの欠失iplication 19から23。歴史的には、個々のエフェクターをコードする遺伝子の欠失はほとんど細胞内増殖のための弱毒株をもたらしません。この現象は、冗長機能やエフェクターのパラロガスコピーを含むいくつかの仮説に起因している。
いくつかの病原因子は、宿主細胞関連細胞内増殖24の文脈で表現されます。私たちは、特定のエフェクターのみ 原虫感染の文脈で表現されていた場合、エフェクターの寄与の両方をin vitroで培養した野生型株と比較することができなかったことを合理化した。それは文化25に固定相に入ると複製から透過位相にはL. pneumophila遷移します。フェーズのスイッチング·表現型は、細胞内の成長中に発生した、運動性26の鞭毛のアセンブリを介して例示されている栄養の枯渇を表しています。なぜならL.レジオネラはもっとINVAですsiveと病原性原虫の細胞から採取したときに、私たちは、それが宿主のマクロファージに遭遇したときに、より忠実に細菌の病原性の状態を表現してアッセイを開発しようとした。
この目的のために、我々は両方（標的細胞）最初（プライミングセル）と第2段の感染症のための任意の適切なホストを収容することができる汎用性の高い原虫プライミングアッセイを開発した。感染プロセスが安定して緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現する細菌の使用を介して扱いやすいです。原虫カステラーニアメーバの感染モデルが広くフィールド27で用いられた方法論に従っています。プライミング工程、Lのpneumophilaの株はラベルの付いた"透過"バクテリア（ 図1A）を生成するために、液体媒体中の固定相にin vitroで培養される。細菌は、次のAの単層を感染させるために使用されている細胞内のライフサイクルの後期を達成するために、18時間カステラーニ 。大きな空胞は含まれている細菌は蛍光顕微鏡（ 図1A）を使用して、この時点で可視化することができる。原生動物の細胞は、その後溶解し、溶解物から回収された細菌を蛍光プレートリーダーを用いて512 nmでの発光のために測定されています。蛍光は、標的細胞の感染（ 図1、*相関曲線）の多重オブ感染度（MOI）を計算するために光学濃度と相関している。浸潤（T 0）と18時間後の浸潤（T 18）の後に、標的細胞は細胞内細菌を表す、蛍光を定量化する。蛍光を顕微鏡およびフローサイトメトリーによって監視することができ、生菌数をコロニーメッキを介して測定することができます。プライミングアッセイは常に野生型Lで感染症を伴っているニューモとドット/ ICM IV型分泌系（ΔDOTA）（ 図1A）における欠損株。これは重要なことは、野生型との間の直接比較のための内部統制を提供ND感染過程で使用される任意の同質遺伝子変異株。プライミング段階で無毒ΔDOTA株を含めることは、in vitroで培養する同質遺伝子変異株に関連付けられた弱毒成長の表現型を観察するためのしきい値を設定します。
Protocol
Representative Results
Discussion
細菌の遺伝子発現はしっかりライフサイクルの進行や周囲の微小環境内の信号への応答の組み合わせを介して制御されます。そのようなLと空胞変性病原体ファゴソームで仕切ら時ニューモは宿主細胞由来の手がかりの多くに対応しています。宿主細胞内の栄養素の枯渇の集団結果、細菌は、その後の宿主細胞は25〜成功普及するために必要な因子を発現させることによ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、原生動物の細胞感染のためのテンプレートを提供するための博士クレイグロイ博士とダリオザンボーニに感謝します。原稿の重要なレビューのために博士はルルカンブロンヌ、我々は、博士Jagdeep Obhrai博士ジョージパーディ、博士フレッドヘフロン機器や試薬のトッドウィズナーに感謝します。フローサイトメトリーは、OHSUのフローサイトメトリーの共有リソースの施設で行われました。この作品は、オレゴン州とNIHの助成金、R21 AI088275（EDC）の医学研究財団からの助成金によって部分的にサポートされていました。
Materials
| Reagent | |||
| chloramphenicol | Fisher Scientific | BP904-100 | antibiotic |
| IPTG | Fisher Scientific | BP1755-10 | |
| ACES | Sigma | A9758-1KG | media component |
| ATCC medium: 712 PYG | ATCC | growth media for protozoans | |
| 1X PBS | Fisher Scientific | SH30256FS | phosphate buffered saline |
| activated charcoal | Fisher Scientific | C272-212 | media component |
| yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | media component |
| peptone | BD Diagnostics | 211677 | media component |
| agar | Fisher Scientific | BP1423-2 | media component |
| L-cysteine, 99%+ | Acros organics | 173601000 | media supplement |
| Ferric nitrate nonahydrate | Fisher Scientific | I110-100 | media supplement |
| Equipment | |||
| EVOS fl | AMG | EVOS fl | fluorescence microscope |
| Smart Spec Plus | Bio-Rad | 170-2525 | spectrophotometer |
| 5810 R centrifuge | Eppendorf | 22627023 | bench top centrifuge |
| Repeater plus | Eppendorf | 22230201 | repeating pipette |
| SpectraMax Gemini EM | Molecular Devices | microplate reader | |
| Softmax Pro 5.3 | Molecular Devices | 0200-310 | microplate reader software |
| 5424 microfuge | Eppendorf | 22620401 | table top microcentrifuge |
| Fast-release pipette pump II | Scienceware | 379111010 | pipette aid |
| FACS Calibur | BD Bioscience | flow cytometer | |
| FlowJo 7.6.1 | FlowJo | license | flow cytometery software |
| 15 ml tube | BD Falcon | 352096 | polypropylene conical tube |
| 1.6 ml microfuge tube | Neptune | 3745.X | microcentrifuge tubes |
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