Protozoan - 중이오 박테리아와 취급하기 쉬운 포유류의 세포 감염
Summary
이 기술은 이전 포유류의 세포의 감염에 대한 자연 protozoan 호스트 세포에 미리 재배되고 세균 병원균의 세포 성장을, 수확 정상화하고 계량화 할 수있는 방법을 제공합니다. 이 메소드는 프라이밍 단계뿐만 아니라 대상 셀 유형에 대한 호스트 세포의 다양한 수용하기 위해 수정할 수 있습니다.
Abstract
대부분의 세포 내 세균 병원균이 있습니다. 환경에서 확산을위한 자연 저수지로 민물 protozoans를 사용하여 Legionella pneumophila, 부대 '폐렴의 원인이되는 에이전트는 먼저 이전 포유류의 대 식세포의 감염 protozoan 세포에서 수확 체외 배양 균에 비해 병원성 이점을 얻게되었습니다. 이 중요한 독성 요소가 제대로 체외로 표현되지 않을 수 있습니다 제안합니다. 우리는 프라이밍 L.위한 다루기 쉬운 시스템을 개발 포유류의 세포 감염에 대한 자연 protozoan 호스트 Acanthamoeba castellanii을 통해 pneumophila 사전. 모든 독성 요소의 기여는 protozoan의 프라이밍 후 야생 형 박테리아에 돌연변이 변종의 세포 성장을 비교하여 검사 할 수 있습니다. GFP-표현 야생 타입과 돌연변이 L. pneumophila의 긴장은 프라이밍 단계에서 protozoan monolayers를 감염하는 데 사용과 세포 성장의 후반 단계에 도달 할 수 있습니다. 형광 박테리아는 다음이 감염된 세포를 채취와 포유류의 대 식세포에 후속 감염 박테리아의 비교 숫자를 생성하는 분광 광도법에 의해 표준화되어 있습니다. 정량화를 들어, 라이브 박테리아는 형광 현미경, 유동 세포 계측법, 그리고 식민지 도금하여 사용 감염 후 모니터링됩니다. 이 기술은 강조하고 자연 수집 경로에 발생 될 환경을 모방하여 호스트 세포에 의존 유전자 발현의 기여에 의존하고 있습니다. 이 방법은 병원성 우위를 확보하기위한 수단으로 중간 호스트를 사용하는 세균을 수용하기 위해 수정할 수 있습니다.
Introduction
수많은 세균 병원체는 세포 내 구획의 생존과 복제 호스트 세포를 이용하기 위해 일반화 된 전략을 적응하고 있습니다. 많은 경우, 병원성 메커니즘은 protozoan과 metazoan 세포 사이의 비슷합니다. 그러나,이 두 microenvironments은 매우 다른과 독성 요인 1-4의 미분 표현 될 수 있습니다. 이 부대 '병 박테리아 Legionella pneumophila는 ubiquitously 5 전 세계적으로 담수 환경과 연결되어 있습니다. 중요한 것은, L. pneumophila는 유전자 6-8을 재배에서 체외보다 다른 protozoan 셀을 종료 세균의 글로벌 유전자 발현 프로파일을 제안, 인간 단핵 세포 병원성 이득의 감염 이전에 protozoan 세포에서 재배. 자연에서 민물 amoebae는 침입 세균의 급속한 확대를 위해 영양이 풍부한 굴레를 제공합니다. L. 인간의 취득 pneumophila는 대개 세균을 포함 오염 된 물방울의 흡입에 따라 결정됩니다. 그것은 가능성이 이러한 방울 항구 protozoan 세포 관련 세균이, protozoan 전지는 기존의 수처리 관행 9,10에 더 강한 위치. 11-13 protozoan 호스트 세포에서 세균의 세포 수명주기와 거의 동일한 방식으로 폐 폐포 대 식세포 진행의 감염.
생존과 진핵 세포에서 복제하기 위해, L. pneumophila 다트 / ICM은 숙주 세포 14-16의 세포 기질에 거의 300 '이펙터'단백질을 제공하는 칭했다 전문 유형 IVb 분비 시스템을 사용합니다. 이러한 효과기 단백질은 집합 적으로 세균 17,18의 복제 허용 구획을 생성하기 위해 셀룰러 프로세스를 파괴하는 기능을 수행합니다. 세포 복수에 결함이있는 변종의 점 / ICM 전송 결과를 구성하는 26 유전자의에서 삭제iplication 19-23. 역사적으로, 개별 이펙터 인코딩 유전자의 삭제는 거의 세포 성장을위한 감쇠 변종이 발생하지 않습니다. 이러한 현상은 중복 기능과 effectors의 paralogous 사본 등 여러 가지 가설에 기인되었습니다.
일부 독성 요소는 호스트 세포 관련 세포 성장 (24)의 맥락에서 표현됩니다. 우리는 특정 이펙터 만 protozoan 감염의 맥락에서 표현 된 경우, 이펙터의 노력이 모두 체외에서 배양 된 야생 타입의 변형과 비교되지 않을 수 rationalized. replicative에서 투과성 단계로 L. pneumophila는 전환이 문화 25 고정 단계에 들어가면서. 위상 전환 표현형은 세포 성장을하는 동안 발생 및 운동성 26 flagella의 조립을 통해 예시되어있는 영양소를 고갈를 나타냅니다. 때문에 L. pneumophila 더 inva입니다protozoan 세포에서 수확 때 sive 및 악성, 우리는 호스트 대 식세포가 발생 될 때 더욱 충실 세균의 병원성 상태를 표현하는 검정을 개발을 모색하고 있습니다.
이를 위해, 우리는 첫 번째 (프라이밍 세포)와 두 번째 (대상 셀) 무대 감염 모두에 대한 적절한 호스트를 수용 할 수있는 다목적 protozoan의 프라이밍 분석을 개발했습니다. 감염 과정은 안정적으로 녹색 형광 단백질 (GFP)을 표현하는 박테리아의 사용을 통해 다루기 쉬운 것입니다. protozoan Acanthamoeba castellanii의 감염 모델은 널리 필드에 27에서 사용되는 방법론을 따른다. 프라이밍 단계 L.에게 들어 pneumophila의 긴장이 표시 '투과성'박테리아를 (그림 1A) 생산 액체 미디어에 고정 단계로 체외에서 재배되고있다. 박테리아는 다음 A.의 monolayers를 감염하는 데 사용됩니다 castellanii 18 시간 동안 세포 생활주기의 후반 단계를 달성합니다. 대형 액포가 포함되어ING 박테리아는 형광 현미경 (그림 1A)를 사용하여이 시점에서 시각화 할 수 있습니다. Protozoan 전지는 다음 lysed되고 lysate에서 발견 한 박테리아는 형광 플레이트 리더를 사용하여 512 nm의에서 방출 측정합니다. 형광은 타겟 세포의 감염 (그림 1, * 상관 관계 곡선)에 대한 다중성 수준의 감염 (나 역시)를 계산하는 광학 밀도와 상관 있습니다. 침공 (T 0) 18 시간 후 침공 (T 18) 후, 대상 세포는 세포 내 박테리아를 대표하는 형광에 대한 평가합니다. 형광은 현미경과 유동 세포 계측법에 의해 모니터링 할 수 있으며, 가능한 카운트는 식민지 도금을 통해 측정 할 수 있습니다. 프라이밍 분석은 항상 야생 형 L.과 감염에 의해 동반 pneumophila 및 도트 / ICM 유형 IV 분비 시스템 (Δ dotA) (그림 1A)에 결함이 부담. 이 중요한 야생 형 사이의 직접 비교에 대한 내부 통제를 제공합니다감염 과정에 사용되는 차있는 isogenic 돌연변이 변종. 프라이밍 단계 동안 avirulent Δ dotA 변형의 포함은 체외에서 배양 아르 isogenic 돌연변이 변종과 관련된 감쇠 성장 phenotypes의 관찰에 대한 임계 값을 설정합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
박테리아 유전자 발현이 밀접하게 생활주기의 진행과 주변 microenvironment의 신호에 응답의 조합을 통해 제어됩니다. 이러한 L. 같은 Vacuolar 병원균 phagosome에 compartmentalized 때 pneumophila는 호스트 세포 유래 단서의 다양한 응답 할 수 있습니다. 숙주 세포에 영양소를 고갈의 집단 결과, 세균은 이후 숙주 세포 25 성공적인 배포에 필요한 요소를 표현하여 보상. L.는 pneumophila 효율…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 protozoan 세포 감염에 대한 템플릿을 제공하는 박사 크레이그 로이 박사 다리오 잠보니 감사드립니다. 원고의 중요한 검토 박사는 룰루 Cambronne, 우리는 박사 Jagdeep Obhrai 박사 Georgiana 퍼디 박사 프레드 Heffron 및 장비와 시약에 대한 토드 Wisner 감사드립니다. 유동 세포 계측법은 OHSU의 유동 세포 계측법 공유 자원 시설에서 수행되었다. 이 작품은 오리건 주와 NIH 보조금 R21 AI088275 (EDC)의 의학 연구 재단의 교부금으로 일부 지원되었다.
Materials
| Reagent | |||
| chloramphenicol | Fisher Scientific | BP904-100 | antibiotic |
| IPTG | Fisher Scientific | BP1755-10 | |
| ACES | Sigma | A9758-1KG | media component |
| ATCC medium: 712 PYG | ATCC | growth media for protozoans | |
| 1X PBS | Fisher Scientific | SH30256FS | phosphate buffered saline |
| activated charcoal | Fisher Scientific | C272-212 | media component |
| yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | media component |
| peptone | BD Diagnostics | 211677 | media component |
| agar | Fisher Scientific | BP1423-2 | media component |
| L-cysteine, 99%+ | Acros organics | 173601000 | media supplement |
| Ferric nitrate nonahydrate | Fisher Scientific | I110-100 | media supplement |
| Equipment | |||
| EVOS fl | AMG | EVOS fl | fluorescence microscope |
| Smart Spec Plus | Bio-Rad | 170-2525 | spectrophotometer |
| 5810 R centrifuge | Eppendorf | 22627023 | bench top centrifuge |
| Repeater plus | Eppendorf | 22230201 | repeating pipette |
| SpectraMax Gemini EM | Molecular Devices | microplate reader | |
| Softmax Pro 5.3 | Molecular Devices | 0200-310 | microplate reader software |
| 5424 microfuge | Eppendorf | 22620401 | table top microcentrifuge |
| Fast-release pipette pump II | Scienceware | 379111010 | pipette aid |
| FACS Calibur | BD Bioscience | flow cytometer | |
| FlowJo 7.6.1 | FlowJo | license | flow cytometery software |
| 15 ml tube | BD Falcon | 352096 | polypropylene conical tube |
| 1.6 ml microfuge tube | Neptune | 3745.X | microcentrifuge tubes |
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