Medgjørlig pattedyrcelle Infeksjoner med protozoan-primet Bakterier
Summary
Denne teknikken gir en metode for å høste, normalisere og kvantifisere intracellulær vekst av bakterier som er pre-dyrket i naturlige protozo vertsceller før infeksjoner av pattedyrceller. Denne metoden kan bli endret for å imøtekomme en rekke vertsceller for priming scenen samt målet celletyper.
Abstract
Mange intracellulære bakterier bruker ferskvann protozoer som en naturlig reservoar for spredning i miljøet. Legionella pneumophila, den forårsaker agent av Legionærsykdommen lungebetennelse, får en sykdomsfremkallende fordel over in vitro dyrkede bakterier når den først høstes fra protozo celler før infeksjon av pattedyr makrofager. Dette antyder at viktige virulensfaktorer kanskje ikke riktig uttrykt in vitro. Vi har utviklet en medgjørlig system for priming L. pneumophila gjennom sin naturlige protozo vert Acanthamoeba castellanii før pattedyrcelle infeksjon. Bidraget av enhver virulens faktor kan bli undersøkt ved å sammenligne intracellulær veksten av en mutant stamme til villtype bakterier etter protozoan grunning. GFP-uttrykke villtype og mutant L. pneumophila stammer er brukt til å infisere protozo monolag i en grunning trinn og tillates å nå sene stadier av intracellulær vekst. Fluorescerende bakterier blir deretter høstet fra disse infiserte celler og normalisert ved spektrofotometri for å generere sammenlignbare antall bakterier for en etterfølgende infeksjon inn mammalske makrofager. For kvantifisering er levende bakterier overvåkes etter smitte med fluorescens mikroskopi, flowcytometri, og ved kolonien platekledning. Denne teknikken fremhever og er avhengig av bidrag fra verten celle-avhengige genuttrykk ved å etterligne miljøet som ville bli møtt i en naturlig oppkjøp rute. Denne tilnærmingen kan endres for å imøtekomme enhver bakterie som bruker et mellomledd vert som et middel for å få en sykdomsfremkallende fordel.
Introduction
Mange bakterielle patogener har tilpasset generaliserte strategier for å utnytte vertsceller for overlevelse og replikering i en intracellulær kupé. I mange tilfeller sykdomsfremkallende mekanismer er lik mellom protozoan og metazoan celler. Men disse to microenvironments er svært forskjellige, og kan resultere i ulike uttrykk av virulensfaktorer 1-4. Den legionellose bakterien Legionella pneumophila er overalt forbundet med ferskvannsmiljøer verden 5. Viktigere, L. pneumophila dyrket i protozo celler før infeksjon av humane monocytter få en patogen fordel, noe som antyder at global genekspresjonsanalyse profiler av bakterien spennende en protozoan celle er annerledes enn den in vitro dyrket organisme 6-8. I naturen, ferskvann amøber gir næringsrike confines for rask forsterkning av en invaderende bakterier. Menneskelig oppkjøpet av L. pneumophILA er oftest knyttet til innånding av forurensede vanndråper som inneholder bakterien. Det er sannsynlig at disse dråpene havnen protozo celle-tilknyttede bakterier, hvor protozo celler er mer motstandsdyktig mot konvensjonelle vannbehandling praksis 9,10. Infeksjon av lunge alveolære makrofager frem på en måte nesten identisk med den intracellulære livssyklus av bakterien i protozo vertsceller 11-13.
For å overleve og replikere i eukaryote celler, L. pneumophila bruker en spesiell type IVb sekresjon system betegnet Dot / ICM å levere nesten 300 'effektor' proteiner i cytosol av vertscellen 14-16. Disse effektor proteiner kollektivt fungere å styrte cellulære prosesser for å generere en replikering ettergivende rom for bakterien 17,18. Slettinger i noen av de 26 genene som utgjør Dot / ICM transporter resultat i stammer defekte for intracellulær multiplication 19-23. Historisk, sletting av enkelte effektor koding gener sjelden resulterte i stammer svekkede for intracellulær vekst. Dette fenomenet har blitt tilskrevet flere hypoteser, inkludert overflødig funksjon og paralogous kopier av effektorer.
Noen virulensfaktorer kun uttrykt i sammenheng med verten celle-assosiert intracellulær vekst 24. Vi rasjonaliserte at hvis en bestemt effektorfunksjon ble bare uttrykt i sammenheng med protozoan infeksjon, da bidraget fra den effektor ikke kunne sammenlignes med en vill-type stamme da begge ble dyrket in vitro. L. pneumophila overganger fra en replicative til en gjennomsiktig fase når den går inn stasjonær fase i kultur 25. Fasen switching fenotype representerer næringsstoff uttømming oppstod under intracellulær vekst og er eksemplifisert gjennom montering av flageller for motilitet 26. Fordi L. pneumophila er mer Invatende og virulente når høstet fra protozo celler, forsøkte vi å utvikle en metode som mer trofast representert sykdomsfremkallende tilstand av bakterien når det oppstått vert makrofager.
For dette formål, utviklet vi en allsidig protozo grunning analyse som kan romme noen egnet vert for både første (priming celle) og andre (målcellen) scenen infeksjoner. Infeksjonen prosessen er medgjørlig gjennom bruk av bakterier stabilt uttrykker grønt fluorescerende protein (GFP). Infeksjonen modell for protozoan Acanthamoeba castellanii følger en metodikk mye brukt i feltet 27. For grunning trinn, L. pneumophila stammer dyrkes in vitro til stasjonær fase i flytende medier til å produsere merket "transmissive" bakterier (figur 1A). Bakterier er neste brukt til å infisere monolag til A. castellanii i 18 timer for å oppnå et sent stadium av det intracellulære livssyklus. Store vakuoler inneholdering bakterier kan visualiseres på dette tidspunkt med fluorescens mikroskopi (figur 1A). Protozo cellene blir deretter lysert og bakterier gjenvunnet fra lysatet blir målt for emisjon ved 512 nm ved hjelp av en fluorescens plateavleser. Fluorescens er korrelert med optisk tetthet for å beregne multiplisitet-of-infeksjon (MOI) for infeksjon av målceller (Figur 1, * Korrelasjon Curve). Etter invasjon (T 0) og 18 hr etter invasjon (T 18), blir målcellene kvantifisert for fluorescens, representerer intracellulære bakterier. Fluorescens kan overvåkes ved mikroskopi og strømningscytometri, og levedyktige tellinger kan måles gjennom koloni platekledning. Grunning analysen er alltid ledsaget av infeksjoner med villtype L. pneumophila og en belastning defekt i Dot / ICM type IV sekresjon system (Δ DotA) (figur 1A). Dette gir viktigere interne kontroller for direkte sammenligninger mellom villtype ennd eventuelle Isogene mutantstammer brukes i infeksjonsprosessen. Inkludering av avirulent Δ DotA belastning under priming scenen setter en grense for observasjon av svekkede vekst fenotyper forbundet med Isogene mutantstammer som blir dyrket in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bakteriell genekspresjon strengt kontrollert gjennom en kombinasjon av livssyklus progresjon og som reaksjon på signaler i den omkringliggende mikromiljøet. Vacuolar patogener som L. pneumophila svare på en rekke vert celle-avledet signaler når compartmentalized i en phagosome. Som en kollektiv resultat av næringsstoff konsumpsjon i vertscellen, kompenserer bakterien ved å uttrykke faktorer som kreves for vellykket formidling til en etterfølgende vertscelle 25. L. pneumophila innrette…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Craig Roy og Dr. Dario Zamboni for å gi en mal for protozo celle infeksjoner. Vi takker Dr. Jagdeep Obhrai, Dr. Georgiana Purdy, Dr. Fred Heffron og Todd Wisner for utstyr og reagenser, Dr. Lulu Cambronne for kritisk gjennomgang av manuskriptet. Flowcytometri ble utført ved OHSU flowcytometri delt ressurs anlegget. Dette arbeidet ble støttet delvis av en bevilgning fra Medical Research Foundation of Oregon og en NIH stipend R21 AI088275 (EDC).
Materials
| Reagent | |||
| chloramphenicol | Fisher Scientific | BP904-100 | antibiotic |
| IPTG | Fisher Scientific | BP1755-10 | |
| ACES | Sigma | A9758-1KG | media component |
| ATCC medium: 712 PYG | ATCC | growth media for protozoans | |
| 1X PBS | Fisher Scientific | SH30256FS | phosphate buffered saline |
| activated charcoal | Fisher Scientific | C272-212 | media component |
| yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | media component |
| peptone | BD Diagnostics | 211677 | media component |
| agar | Fisher Scientific | BP1423-2 | media component |
| L-cysteine, 99%+ | Acros organics | 173601000 | media supplement |
| Ferric nitrate nonahydrate | Fisher Scientific | I110-100 | media supplement |
| Equipment | |||
| EVOS fl | AMG | EVOS fl | fluorescence microscope |
| Smart Spec Plus | Bio-Rad | 170-2525 | spectrophotometer |
| 5810 R centrifuge | Eppendorf | 22627023 | bench top centrifuge |
| Repeater plus | Eppendorf | 22230201 | repeating pipette |
| SpectraMax Gemini EM | Molecular Devices | microplate reader | |
| Softmax Pro 5.3 | Molecular Devices | 0200-310 | microplate reader software |
| 5424 microfuge | Eppendorf | 22620401 | table top microcentrifuge |
| Fast-release pipette pump II | Scienceware | 379111010 | pipette aid |
| FACS Calibur | BD Bioscience | flow cytometer | |
| FlowJo 7.6.1 | FlowJo | license | flow cytometery software |
| 15 ml tube | BD Falcon | 352096 | polypropylene conical tube |
| 1.6 ml microfuge tube | Neptune | 3745.X | microcentrifuge tubes |
References
- Mahan, M. J., Slauch, J. M., Mekalanos, J. J. Selection of bacterial virulence genes that are specifically induced in host tissues. Science. 259, 686-688 (1993).
- Mahan, M. J., et al. Antibiotic-based selection for bacterial genes that are specifically induced during infection of a host. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 669-673 (1995).
- Rankin, S., Isberg, R. R. Identification of Legionella pneumophila promoters regulated by the macrophage intracellular environment. Infect. Agents Dis. 2, 269-271 (1993).
- Rankin, S., Li, Z., Isberg, R. R. Macrophage-induced genes of Legionella pneumophila: protection from reactive intermediates and solute imbalance during intracellular growth. Infect. Immun. 70, 3637-3648 (2002).
- Fields, B. S. The molecular ecology of legionellae. Trends Microbiol. 4, 286-290 (1996).
- Cirillo, J. D., et al. Intracellular growth in Acanthamoeba castellanii affects monocyte entry mechanisms and enhances virulence of Legionella pneumophila. Infect. Immun. 67, 4427-4434 (1999).
- Cirillo, J. D., Falkow, S., Tompkins, L. S. Growth of Legionella pneumophila in Acanthamoeba castellanii enhances invasion. Infect. Immun. 62, 3254-3261 (1994).
- Faucher, S. P., Mueller, C. A., Shuman, H. A. Legionella pneumophila Transcriptome during Intracellular Multiplication in Human Macrophages. Front Microbiol. 2, 60 (2011).
- Kilvington, S., Price, J. Survival of Legionella pneumophila within cysts of Acanthamoeba polyphaga following chlorine exposure. J. Appl. Bacteriol. 68, 519-525 (1990).
- King, C. H., Shotts, E. B., Wooley, R. E., Porter, K. G. Survival of coliforms and bacterial pathogens within protozoa during chlorination. Appl. Environ. Microbiol. 54, 3023-3033 (1988).
- Horwitz, M. A. Formation of a novel phagosome by the Legionnaires’ disease bacterium (Legionella pneumophila) in human monocytes. J. Exp. Med. 158, 1319-1331 (1983).
- Horwitz, M. A. Phagocytosis of the Legionnaires’ disease bacterium (Legionella pneumophila) occurs by a novel mechanism: engulfment within a pseudopod coil. Cell. 36, 27-33 (1984).
- Horwitz, M. A., Silverstein, S. C. Legionnaires’ disease bacterium (Legionella pneumophila) multiples intracellularly in human monocytes. J. Clin. Invest. 66, 441-450 (1980).
- Burstein, D., et al. Genome-scale identification of Legionella pneumophila effectors using a machine learning approach. PLoS Pathog. 5, e1000508 (2009).
- Zhu, W., et al. Comprehensive identification of protein substrates of the Dot/Icm type IV transporter of Legionella pneumophila. PLoS One. 6, e17638 .
- Nagai, H., Kubori, T. Type IVB Secretion Systems of Legionella and Other Gram-Negative Bacteria. Front Microbiol. 2, 136 (2011).
- Hubber, A., Roy, C. R. Modulation of host cell function by Legionella pneumophila type IV effectors. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 26, 261-283 (2010).
- Shin, S., Roy, C. R. Host cell processes that influence the intracellular survival of Legionella pneumophila. Cell Microbiol. 10, 1209-1220 (2008).
- Berger, K. H., Isberg, R. R. Two distinct defects in intracellular growth complemented by a single genetic locus in Legionella pneumophila. Mol. Microbiol. 7, 7-19 (1993).
- Marra, A., Blander, S. J., Horwitz, M. A., Shuman, H. A. Identification of a Legionella pneumophila locus required for intracellular multiplication in human macrophages. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 9607-9611 (1992).
- Segal, G., Purcell, M., Shuman, H. A. Host cell killing and bacterial conjugation require overlapping sets of genes within a 22-kb region of the Legionella pneumophila genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 1669-1674 (1998).
- Segal, G., Shuman, H. A. Characterization of a new region required for macrophage killing by Legionella pneumophila. Infect Immun. 65, 5057-5066 (1997).
- Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila. Science. 279, 873-876 (1998).
- Haghjoo, E., Galan, J. E. Identification of a transcriptional regulator that controls intracellular gene expression in Salmonella Typhi. Mol. Microbiol. 64, 1549-1561 (2007).
- Molofsky, A. B., Swanson, M. S. Differentiate to thrive: lessons from the Legionella pneumophila life cycle. Mol. Microbiol. 53, 29-40 (2004).
- Hammer, B. K., Tateda, E. S., Swanson, M. S. A two-component regulator induces the transmission phenotype of stationary-phase Legionella pneumophila. Mol. Microbiol. 44, 107-118 (2002).
- Ninio, S., Zuckman-Cholon, D. M., Cambronne, E. D., Roy, C. R. The Legionella IcmS-IcmW protein complex is important for Dot/Icm-mediated protein translocation. Mol. Microbiol. 55, 912-926 (2005).
- Neild, A. L., Roy, C. R. Legionella reveal dendritic cell functions that facilitate selection of antigens for MHC class II presentation. Immunity. 18, 813-823 (2003).
- Molmeret, M., Horn, M., Wagner, M., Santic, M., Abu Kwaik, Y. Amoebae as training grounds for intracellular bacterial pathogens. Appl. Environ. Microbiol. 71, 10-1128 (2005).
- Huws, S. A., Smith, A. W., Enright, M. C., Wood, P. J., Brown, M. R. Amoebae promote persistence of epidemic strains of MRSA. Environ. Microbiol. 8, 1130-1133 (2006).
