Imagerie directe du calcium ER avec Targeted-estérase colorant induit Chargement (TED)

Summary

Targeted-estérase induite colorant chargement (TED) appuie l'analyse de la dynamique intracellulaire des magasins de calcium par imagerie de fluorescence. La méthode se fonde sur le ciblage d'une carboxylestérase recombinant pour le réticulum endoplasmique (RE), où il améliore le démasquage locale de synthétique de faible affinité Ca^{2 +} Colorants indicateurs dans la lumière du RE.

Abstract

Visualisation de la dynamique de calcium est important de comprendre le rôle du calcium dans la physiologie cellulaire. Pour étudier la dynamique de calcium, Ca ^{2 +} fluorescents indicateurs ^de synthèse sont devenus populaires. Ici, nous démontrons TED (= ciblée estérase induite colorant chargement), une méthode pour améliorer la libération de Ca ^{2 +} colorants indicateurs dans la lumière du RE de différents types de cellules. À ce jour, TED a été utilisé dans des lignées cellulaires, les cellules gliales et les neurones in vitro. Bases TED sur l'efficacité, le ciblage d'une activité à haute carboxylesterase à la lumière du RE en utilisant vecteurs constructions recombinant qui carboxylestérases express (CES). Les derniers vecteurs TED contiennent un élément central de CES2 fusionné à une protéine fluorescente rouge, permettant ainsi à l'imagerie à deux couleurs simultanément. La dynamique du calcium libre dans l'ER sont imagés dans une couleur, tandis que la structure ER correspondant apparaît en rouge. Au début de la procédure, les cellules sont transduites avec un lentivirus. Ensuite, les cellules infectées par unre ensemencées sur des lamelles pour enfin permettre l'imagerie des cellules vivantes. Ensuite, les cellules vivantes sont mises en incubation avec l'ester d'acétoxyméthyle (AM-ester) sous forme de faible affinité de Ca ^{2 +} indicateurs, par exemple Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM, ou en alliage d'aluminium-Fura2-AM. L'activité de l'estérase dans les clive ER hors chaînes latérales hydrophobes à partir de la forme AM du Ca ^{2 +} et un indicateur fluorescent ⁺ complexe colorant / Ca ² hydrophile est formé et pris au piège dans la lumière du RE. Après chargement colorant, les cellules sont analysées au microscope à balayage laser confocal inversé. Les cellules sont continuellement perfusées avec des solutions de Ringer-like et la dynamique de calcium ER sont directement visualisés par l'imagerie time-lapse. libération de calcium à partir de l'ER est identifiée par une diminution de l'intensité de fluorescence dans les régions d'intérêt, tandis que le remplissage de la réserve de calcium ER produit une augmentation de l'intensité de fluorescence. Enfin, la variation de l'intensité de fluorescence au cours du temps est déterminée par le calcul de AF / F _0.

Introduction

Afin de résoudre réponses calciques physiologiques de l'ER, nous avons développé une nouvelle stratégie pour améliorer le piégeage des colorants sensibles de calcium synthétiques dans l'ER. La méthode permet à l', non perturbatrice surveillance en temps réel directement sans calcium ER en présence de calcium extracellulaire.

Fonction et signalisation de calcium ER

signaux de calcium se trouvent dans différents types cellulaires, cellules musculaires par exemple, les neurones et les cellules gliales et leur gamme de fonctions de médiation contraction musculaire à une implication dans la transmission synaptique dans l'apprentissage et de la mémoire ^1,2. Les variations de la concentration en calcium libre sont de grand intérêt scientifique parce que le calcium est impliqué dans la régulation de la transcription génique, la prolifération cellulaire, l'excitabilité neuronale, la mort cellulaire et autre signalisation cellulaire événements ^1-7. Tous ces signaux calciques cellulaires sont fonctionnellement liés et contribuent à intracellulaires de calciummagasin ^8-10 Dynamics.

Une caractéristique commune à tous les signaux de calcium est le flux de calcium entre l'espace extracellulaire, le cytosol et organites, principalement l'ER et les mitochondries. Cela provoque des changements dynamiques de la concentration de calcium dans ces organites, qui sont détectées par différents éléments de signalisation. En général, la concentration en calcium dans les intervalles entre ER 100 à 800 pM, dans le cytosol de la concentration de calcium est proche de 100 nm, et dans l'espace extracellulaire de la concentration est de l'ordre de 1 à 2 mM. Par conséquent, il est une force motrice chimique élevée pour le flux de calcium vers le cytosol ^2,9,10.

Les signaux calciques ER dérivés les plus couramment étudiées dépendent de la stimulation des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG), qui a ensuite activent la phospholipase C (PLC). PLC à son tour produit l'inositol 1,4,5-triphosphate (IP ₃₎ ^1. Lors de la liaison de _IP3 à son receptor (IP _3-Rec, figure 1) dans le ER-membrane, les ions calcium sont libérés à partir de la lumière du RE. Historiquement, IP libération de calcium ₃ médiation de l'ER est le premier – même si indirectement – mesurée dans les cellules pancréatiques acineuses par Streb et al en 1983. ^11. Cette publication a suggéré pour la première fois une cascade de signalisation impliquant l'acétylcholine, la phospholipase C et IP _3. Cette façon de libération de calcium est généralement appelé IP libération de calcium ₃ induit (IICR) (Figure 1). Activation de kinases dépendant de la phospholipase Cy par récepteurs tyrosines kinases liens à l'action des facteurs de croissance et des facteurs neurotrophiques pour ER signalisation IP après ₃ Altitude ¹² calcium. En plus de IICR, l'élévation du calcium peut être médiée par l'entrée du calcium ionotropique, par exemple via des canaux calciques voltage-dépendants (Ca _V), et après la libération de calcium induite par le calcium (CICR) par ryanodine reprécepteurs (RyR). IICR et CICR sont physiologiquement liés à l'entrée du calcium magasin fonctionnant (SOCE). SOCE comprend l'action de STIM (molécule interagissant stroma), qui est un capteur pour ER libération de calcium. STIM a été montré pour stimuler l'entrée du calcium extracellulaire par les voies de passage des récepteurs potentiels (TRP) ^13, les canaux calciques Orai ¹⁴ et même des canaux calciques voltage-dépendants ¹⁵ (Figure 1). Perte de calcium ER est dynamiquement sauvé par l'action du réticulum sarco-endoplasmique ATPase de calcium (SERCA), qui active les pompes de retour de calcium dans le RE. Blocage de la SERCA avec des médicaments tels que thapsigargine dévoile une perte continue de calcium ER dans le compartiment cytosolique. Ce ER calcium «fuite» est causée par des complexes de pores intramembranaires ER tels que le complexe de protéine Sec61 ^16,17 (figure 1).

En 1998, Berridge a publié un modèle, le «neurone dans un modèle neuronal", which suggère un rôle physiologique de principe de l'ER dans l'intégration de calcium neuronal ^5. Ce modèle estime l'existence d'un système de membrane du RE continue formant une "image" intracellulaire de la membrane plasmique des neurones ^5. Ce système de membrane eucaryote binaire a été prétendu être une condition sine qua non pour l'intégration spatiale et temporelle des signaux calciques lents et rapides dans les neurones. signaux calciques qui se produisent soit concomitamment ou ultérieurement dans différents épines ou dendrites du neurone même sont conférés au soma ou le noyau via l'ER, où ils se résument ^5,18 de la cellule. Ensuite, leur somme peut avoir des effets sur l'excitabilité des neurones, la régulation de la transcription des gènes ou l'intégration des cascades de signalisation. Ainsi, l'ER soutient l'intégration de signaux calciques. Une condition préalable à ce concept est la continuité de l'ER dans une seule cellule, qui a été revendiquée par plusieurs études et qui a été prouvé au moins pour somato-dzones endritic et à courte distance des projections axonales ^19-21. Qu'il y ait continuité ER dans les projections axonales longues est un sujet de débat.

Les stratégies visant à mesurer le flux de calcium libre sur la membrane du RE

signaux calciques sont le plus souvent suivies dans le cytosol ^22,23. Par conséquent, il ne peut pas facilement être distingué s'il Ca ^{2 +} se déverse dans le cytosol de extracellulaire ou des réserves intracellulaires ^6,24. Pour contourner cette limitation, les stratégies méthodologiques pour l'imagerie directe de calcium ER ont été développés. En résumé, les stratégies suivantes sont utilisées: (1) ER-ciblées génétiquement protéines indicateurs ^25-27 faible affinité Ca ^{2 +} indicateurs à base de protéines utilisent la protéine bioluminescente aequorin ou GFP en combinaison avec une protéine de détection de calcium.. Ces Ca ^{2 +} indicateurs génétiquement modifiés (GECIS) peutêtre ciblée à l'urgence à l'aide d'un peptide signal et sont activement conservés à l'urgence en utilisant un motif de rétention et de récupération. Common ER Ca ^{2 +} base des indicateurs sur le principe de Cameleon Cameleon et sont la YC4.3 ^26,28; Cameleon scission YC7.3ER ²⁹ et Cameleon D1 ^30. (2) Direct chargement de colorant à base d'estérase de AM-ester de faible affinité Ca ^{2 + 31,32} indicateurs. Des colorants indicateurs (Mag-Fura2-AM, Mag-Fluo4-AM ou Fluo5N-AM) dérivés AM passer l' membranes biologiques dans un état lipophile, calcium insensible. Puis, dans le cytosol, ainsi que dans l'urgence, estérases endogènes cliver du groupe AM-ester et relâchez le Ca ^{2 +} indicateur, laissant derrière lui une certaine quantité de colorant actif dans le cytosol et dans l'urgence. Par conséquent, cette approche est utile dans des conditions d'une forte concentration de calcium dans le RE aussi longtemps que la concentration de calcium cytosolique reste bien en dessous de la deLimite de protection des indicateurs de faible affinité, en particulier pendant signaux calciques caractéristiques (par exemple nM à faible M). (3) chargement AM-ester en association avec la membrane plasmique perméabilisation ^32. Cytosolique de préférence Ca ⁺ indicateur restante est éliminée par ^deux plasma perméabilisation de la membrane avec de petites quantités d'un détergent "doux" (par exemple saponine) dans un tampon intracellulaire artificielle. Ainsi, les membranes intracellulaires peuvent être stimulées, par exemple avec l'IP ₃ dans le tampon intracellulaire, directement par "pores" dans la membrane plasmique. (4) Dialyse du cytosol sous configuration cellule entière et des mesures simultanées de Ca ^{2 +} dans la lumière du RE et le cytosol ^32,33. Une cellule est d'abord chargé avec une faible affinité Ca ^{2 +} indicateur (par exemple Mag-Fura2- AM, quotientométrique, UV). Ensuite, à l'aide d'une pipette de patch, tout reste CYTosolic faible affinité Ca ⁺ indicateur ² est dialysée sur le cytosol avec un tampon contenant un ^{Ca2 +} indicateur de haute affinité (par exemple Fluo-3, de la lumière visible). Cette stratégie permet l'enregistrement simultané de signaux dérivés cytosolique et ER. (5) Targeted-estérase colorant induit chargement ^8,34. Un carboxylestérase (CES) est destiné à la lumière de l'ER et fournit une haute activité de l'estérase de piégeage efficace de la forme AM-ester de faible affinité Ca ^{2 +} indicateurs.

Targeted-estérase induite colorant chargement (TED)

Pour améliorer le ciblage de faible affinité Ca ^{2 +} indicateurs à la lumière du RE, TED a été développé. TED nécessite la surexpression d'une carboxylestérase ER ciblée de la souris (CES2) (figure 2), ce qui est réalisé par l'intermédiaire d'assemblage d'expression. Les cellules exprimant un CES-construction recombinante sont incubés avec la forme AM-ester d'un calcium dansdicateur colorant (Fluo5N-AM, figure 2). Puis, dans l'urgence, le colorant est converti en Ca ^{2 +} sensibles, membrane imperméable Ca ^{2 +} complexe indicateur (Fluo5N/Ca ^{2 +)} par la forte activité de l'estérase, piégeant ainsi le colorant à une concentration élevée dans la lumière du RE ^{8 , 34.} La méthode est particulièrement utile pour étudier ER calcium-release via les IICR-voies, par exemple via des récepteurs métabotropiques, purinergiques ou glutamate ^8,34 et de visualiser ER épuisement de calcium via "canaux de fuite" directement, par exemple après le blocage de la SERCA ^{17 , 34.} Pour notre expérience, la faible affinité Ca ^{2 +} indicateur Fluo5N-AM est actuellement le meilleur indicateur disponible pour une utilisation avec la stratégie de chargement colorant TED. Fluo5N-AM a une faible affinité pour le Ca ^{2 +} (constante de dissociation K _D ~ 90 um, figure 2), est presque non-fluorescent dans sa AM-forme, mais fournit une grande émission de fluorescence sur Calciucontraignant m ^8,34. Le complexe Fluo5N/Ca ^{+ 2} peut être excité par une source de lumière standard de ~ 490 nm, ce qui correspond à des colorants standards tels que le FITC, Alexa 488, ou EGFP. Signaux calciques cytosoliques guère atteindre une concentration dans la gamme des basses pM et sont donc à peine détectés par Fluo5N dans le cytosol ^35.

Pour améliorer les performances de TED, plusieurs constructions de vecteurs recombinants ont été développés (Figure 3). A l'origine, les vecteurs TED basé sur la séquence codante du CES2 (RefSeq numéro d'accession NM_145603, CES2c) et meilleure performance TED est observée avec une expression stable de constructions CES. Nouveaux vecteurs TED expriment un élément central de CES2 fusionnée à la protéine de fluorescence rouge TagRFP-T2 ^36. Ces vecteurs ont l'avantage qu'ils peuvent être utilisés pour identifier les cellules transduites et d'utiliser la fluorescence rouge comme un contrôle interne pour la normalisation des changements dans Fluo5N/Ca ^{2 +} fluorescence. La fluorescence rouge offre également la possibilité de visualiser la répartition structurelle de l'ER et des changements dans la dynamique ER dans des conditions de stimulation.

Protocol

Ce protocole introduit TED appliqué aux lignes de cellules, les neurones hippocampiques et les cellules gliales corticales. Performances TED est meilleur quand vecteurs TED sont exprimé de façon stable, par exemple par des vecteurs lentiviraux. Un aperçu schématique de la méthode TED est montré dans la figure 4. 1. Préparation des solutions Les solutions suivantes doivent être préparés avant de commencer et peuvent être stockés comme i…

Representative Results

Ce protocole prévoit une approche non perturbatrice pour l'imagerie directe de libre calcium ER. Faible affinité synthétique Ca 2 + indicateurs sont libérés et piégés dans la lumière du RE à l'aide d'une ER ciblée, l'activité de l'enzyme estérase recombinante. Amélioration de chargement des Ca 2 + colorants indicateurs à la lumière du RE permet une imagerie directe et rapide des urgences dynamique de magasins de calcium. Les types de cell…

Discussion

Les avantages et les inconvénients de la méthode TED ont été largement débattues dans les publications récentes ^34,35. Comparé à d'autres méthodes décrites ci-dessus, TED contourne le problème de la perturbation et la perfusion des cellules. En outre, deux aspects méritent d'être soulignés. Le principe de TED pour ER imagerie de calcium nécessite (1.) L'expression ciblée d'une carboxylestérase actif dans la lumière du RE à l'aide de vecteurs construits TED et (2.) La lib…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalogue Number	Comments
(S)-3,5-DHPG (Dihydroxyphenylglycine)	Tocris	0805
5′;-ATP-Na2, ATP disodium salt hydrate	Sigma	A26209-1G
B-27 supplement,50x	Invitrogen	17504-044
Carbamoylcholine chloride (Charbachol)	Sigma	C4382-1g
Cyclopiazonic acid (CPA)	Ascent scientific	Asc-300
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650
DMEM with Glutamax	Invitrogen-Gibco	31966-047
Dulbecco’s PBS without Ca/Mg 1x	PAA	H15-002
Fetal calf serum	Invitrogen-Gibco	10270-106
Fluo-5N-AM, 10 x 50 μg	Invitrogen	F14204
Glutamate	Ascent scientific	Asc-049
Glutamax	Invitrogen	35050-038
Ham’s F12 nutrients mixture	Invitrogen-Gibco	21765-029
Hank’s BSS(1x) without Ca,without Mg, with Phenol Red, HBSS	PAA Laboratories	H15-010
Horse serum	SHD3250YK	Linearis
Ionomycin Ca2+ salt	Ascent scientific	Asc-116
murine EGF	PreproTech	315-09
N2 supplement 100x	Invitrogen	17502-048
Neurobasal medium	Invitrogen-Gibco	21103-049
Pluronic F127, low UV absorbance,2g	Invitrogen	P6867
Poly-DL-ornithine hydrobromide PORN	Sigma	P8638
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma	P7280
Poly-L-Lysin	Sigma	P2636
Thapsigargin	Calbiochem	586005-1mg
TryLE Express	Invitrogen	12605-028
Trypsin	Worthington	LS-003707
Trypsininhibitor from Glycine MAX (soybean)	Sigma	T6522
			Materials
Confocal system: inverted laser scanning microscope: FV1000 with IX81	Olympus		user-specific configuration
Confocal system: laser combiner FV10 and diode lasers (405, 473, 559, 635)	Olympus		user-specific configuration
Confocal system: scan head FV10-SPD with spectraldetector	Olympus		user-specific configuration
Heater controller TC-344B	Warner Instruments	64-0101	to control in line solution heater
NIH ImageJ software	WS Rasband, ImageJ, US National Institutes of Health, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997–2006
Objective: UAPON20XW340 NA 0,7 WD 0,35	Olympus	N2709100
Objective: UPLFLN40XO	Olympus	N1478700
Objective: UPLSAPO60XO/1.35, WD=0.15	Olympus	N1480700
Perfusion chamber, inverse	custom-made
Perfusion chamber, RC-49FS	Warner Instruments	W4 64-1709
Perfusion tube: PT-49	Warner Instruments	64-1730	for perfusion
Peristaltic pump MiniPlus 3 (4 channels)	Gilson	n.a.	perfusion pump
Single inline solution heater SH-27B	Warner Instruments	64-0102	controlled by heater controller
Suction tubes: ST3R	Warner Instruments	64-1407	for perfusion
Heating insert: Tempocontrol 37-2 digital 2-channel	Pecon	n.a.