ターゲット-エステラーゼ誘起染料の読み込み（TED）とERカルシウムの直接イメージング
Summary
標的と-エステラーゼ誘導し染料ロード（TED）は、蛍光イメージングによる細胞内カルシウムストアのダイナミクスの解析をサポートしています。それは合成の低親和性のCaローカルマスキングを改善し、小胞体（ER）に換えカルボキシルエステラーゼの標的に対するメソッド拠点<sup> 2 +</supER内腔>インジケーター色素。
Abstract
カルシウム動態の可視化は、細胞生理学におけるカルシウムの役割を理解することが重要である。カルシウム動態を調べるために、合成蛍光Ca 2 +のウインカが人気となっている。ここでは、TED（=ターゲット·エステラーゼ誘導される色素ロード）、のCa 2 +放出異なる種類の細胞の小胞体内腔におけるインジケーター色素を改善するための方法を示しています。今日まで、TEDは、細胞株、グリア細胞、およびin vitroでのニューロンに使用した。ベクターコンストラクトを用いた小胞体内腔に高いカルボキシルエステラーゼ活性の標的効率的組換えでTED拠点その急行カルボキシルエステラーゼ（CES）。最新のTEDベクトルは、このように同時2カラー撮像を可能にし、赤色蛍光タンパク質に融合CES2のコア要素を含んでいる。対応するER構造が赤で表示されている間、ER内遊離カルシウムのダイナミクスは、一つの色に結像される。プロシージャの先頭で、細胞をレンチウイルスで形質導入されています。その後、感染した細胞再は、最終的に生細胞のイメージングを可能にするためにカバースリップ上に播種した。その後、生きている細胞は、インスタンスFluo5N-AM、MAG-Fluo4-AM、またはMAG-たFura2-AMのため、低親和性のCa 2 +指標のアセトキシメチルエステル（AM-エステル）フォームでインキュベートする。のCa 2 +指標と親水性蛍光色素/ Ca 2 +の錯体のAM形からの疎水性側鎖を切断オフER内エステラーゼ活性が形成され、ER内腔に閉じ込められている。色素ローディング後、細胞を倒立型共焦点レーザー走査顕微鏡で分析される。細胞は継続的にリンガーのようなソリューションで灌流し、ERのカルシウムダイナミクスタイムラプスイメージングによる直接可視化されています。 ERカルシウムストアの補充は、蛍光強度の増加を生じるのに対し、ERからのカルシウム放出は、関心のある領域における蛍光強度の減少によって識別される。最終的に、経時的に蛍光強度の変化はΔF/ F 0の計算によって決定される。
Introduction
ERの生理的なカルシウム応答を解決するために、我々は、ERに合成炭酸カルシウム感受性色素の捕捉を改善するための新しい戦略を開発した。方法は、細胞外カルシウムの存在下で自由ERカルシウムの直接、無停止リアルタイム監視を可能にします。
ERカルシウムの機能とシグナリング
カルシウム信号は、異なる細胞型、 例えば、筋肉細胞、ニューロンおよび学習および記憶1,2におけるシナプス伝達の関与に筋収縮を媒介からグリア細胞とその機能の範囲に見出される。カルシウムは遺伝子転写、細胞増殖、神経細胞の興奮性、細胞死および他の細胞シグナル伝達事象1-7の調節に関与しているため、遊離カルシウム濃度の変化は、高い科学的関心である。これらのすべての細胞内カルシウムシグナルは、細胞内カルシウム機能的に接続され、貢献店舗ダイナミクス8-10。
すべてのカルシウムシグナルの間で共通の特徴は、主にERやミトコンドリア、細胞外空間、細胞質と細胞小器官の間でのカルシウムの流れです。これは、異なるシグナル伝達成分によって感知されるこれらの細胞小器官内のカルシウム濃度のダイナミックな変化を引き起こす。一般的には100〜800μmの間のERの範囲内カルシウム濃度は、細胞質ゾルのカルシウム濃度は、100nMの近隣にあり、細胞外空間内濃度は1〜2 mMの程度である。従って、細胞質ゾルのカルシウム2,9,10に向かって流れに対して高い化学的駆動力が存在する。
最も一般的に調査し、ER由来のカルシウムシグナルは、その後ホスホリパーゼC（PLC）を活性化するGタンパク質共役受容体（GPCR）の刺激に依存します。順番にPLCはイノシトール1,4,5 -三リン酸（IP 3）1を生成します。その視聴にIP 3の結合時ER-膜におけるeptor（IP 3 -録音、 図1）は 、カルシウムイオンは、ER内腔から放出される。歴史的には、ERからIP 3媒介カルシウム放出は初めてだった-たとえ間接的に- Streb ら腺膵臓細胞で測定された1983年11インチ 。本書は、初めてアセチルコリン、ホスホリパーゼC、およびIP 3が関与するシグナル伝達カスケードを示唆した。カルシウム放出のこの方法は、一般的にIP 3誘発性カルシウム放出（IICR）（ 図1）と呼ばれます。受容体チロシンキナーゼリンクIP 3標高12後シグナリングERカルシウムの増殖因子や神経栄養因子の作用によるホスホリパーゼCγのキナーゼ依存的活性化。 IICRに加えて、カルシウム上昇は電位依存性カルシウムチャネル（CA V）、およびリアノジン再によるその後のカルシウム誘発性カルシウム放出（CICR）を経由して、たとえば、イオンチャネル型カルシウム流入によって媒介され得るceptors（RYR）。 IICRとCICRは生理的にストア作動性カルシウム流入（SOCE）にリンクされています。 SOCEはERのカルシウム放出するためのセンサであるSTIM（間質相互作用分子）の作用を有している。 STIMは、一過性受容体電位チャネル（トリプトファン）13、往来カルシウムチャネル14、さらには電位依存性カルシウムチャネル15（ 図1）を介して細胞外のカルシウム流入を刺激することが示されている。 ERカルシウムの損失が動的に積極的にポンプカルシウムバックERにサーコ-小胞体カルシウムATPアーゼ（SERCA）の作用によって救出されています。などタプシガルギンなどの薬物とのSERCAをブロックすると、細胞質コンパートメントにERカルシウムの継続的損失を発表。このERカルシウム"リーク"などSec61タンパク質複合体16,17（ 図1）のように小胞体膜内の細孔複合体によって引き起こされる。
1998年には、Berridgeは、モデル、 "ニューロンモデル内ニューロン"、whicを発表hはニューロンのカルシウム5を統合するERの原則生理的役割を示唆している。このモデルは、神経細胞の原形質膜5の細胞内の"画像"を形成する連続的なER膜システムの存在を考慮する。このバイナリ真核生物の膜システムは、ニューロンにおける高速と低速のカルシウムシグナルの時間的·空間的統合のための基本的な前提条件であると主張しました。同じニューロンの異なる棘や樹状突起に同時にまたはその後のどちらか起こるカルシウムシグナルは、細胞の細胞体または彼らは5,18を総括しているERを介して核に付与されています。そして、その合計がシグナル伝達カスケードのニューロンの興奮性、遺伝子転写の調節や統合に影響を与えることがある。したがって、ERは、カルシウムシグナルの統合をサポートしています。この概念の一つの前提条件は、いくつかの研究で主張されていると、少なくとも体性-Dのために証明されている単一のセル内のERの継続ですendriticエリアと短距離軸索投射19-21。長い軸索投射内ER継続性があるかどうかは議論の問題です。
ER膜上の遊離カルシウムの流れを測定するための戦略
カルシウムシグナルは、最も頻繁に細胞質ゾル22,23に監視されています。したがって、容易のCa 2 +を細胞外から6,24又は細胞内貯蔵から細胞質内に流入されているかどうかを区別することができない。この制限を克服するために、直接ERカルシウムイメージングのための方法論的な戦略が開発されている。要約すると、以下の戦略が使用されます。（1）ER-ターゲット遺伝子組み換えタンパク質の指標25-27タンパク質ベースの低親和性のCa 2 +インジケーターはタンパク質を感知カルシウムとの組み合わせで生物発光タンパク質イクオリンやGFPを使用しています。これらの遺伝子組み換えのCa 2 +インジケータ（GECIs）ができますシグナルペプチドの助けを借りて、ERを対象とすることが、積極的に保持し、検索のモチーフを使用してERに保持されます。カメレオン原則上の共通ERのCa 2 +指標ベースとカメレオンYC4.3 26,28です。カメレオンスプリットYC7.3ER 29と、カメレオンD1 30。 （2）インジケーター色素のAM-エステル低親和性のCa 2 + 指標31,32。AM-デリバティブの直接エステラーゼ系色素ローディング （MAG-たFura2-AM、MAG-Fluo4-AMまたはFluo5N-AM）が合格親油性、カルシウムと小文字を区別しない状態での生体膜。その後、細胞質ゾルで同様ERで、内因性エステラーゼAM-エステル基の開裂とは、細胞質内のアクティブな染料ある程度の後ろとERに残して、Ca 2 +のインジケータを解放。細胞質カルシウム濃度が十分にデ以下に留まるようしたがって、このアプローチは限り、ERの高いカルシウム濃度の条件下で有用である特に特徴的なカルシウムシグナル（低μMに例えば nM）を間に低親和性指標の護制限、。 （3） 細胞膜透過性32との組み合わせでAM-エステルローディング。すべて残り細胞質のCa 2 +指示薬は、人工細胞内バッファに"マイルド"洗剤（ 例えばサポニン）少量の細胞膜透過処理によって除去される。したがって、細胞内膜を直接形質膜における"細孔"を介して、細胞内のバッファ内のIP 3を、例えば 、刺激されてもよい。 （4）ER内腔や細胞質ゾル 32,33 中のCa 2の細胞全体の構成や同時測定+下の細胞質ゾルの透析。セルが最初に低親和性のCa 2 +指示薬（ 例えば MAG-たFura2-がロードされAM、）、レシオメトリックUV光。その後、パッチピペット、残っCYTの助けを借りてosolic低親和性のCa 2 +インジケーターは高親和性のCa 2 +指示薬（ 例えばフルオ-3、可視光）を含む緩衝液を用いて細胞質ゾルの外透析されています。この戦略は、細胞質およびER派生信号の同時記録が可能。 （5） 目標-エステラーゼ誘発性染料ローディング 8,34。カルボキシルエステラーゼ（CES）は、ERの内腔に標的化および低親和性のCa 2 +指標のAM-エステル体を効率的に捕捉するための高エステラーゼ活性を提供する。
標的と-エステラーゼ誘導し染料ロード（TED）
ER内腔に低親和性のCa 2 +指標のターゲッティング改善するには、TEDが開発されました。 TEDは、発現構築物によって達成されるER標的マウスカルボキシルエステラーゼ（CES2）（ 図2）の過剰発現を必要とします。換えCES-コンストラクトを発現する細胞は、中のカルシウムのAM-エステルフォームでインキュベートするdicator色素（Fluo5N-AM、 図2）。次に、ERで、染料は、したがって、ER内腔8に高濃度で染料をトラップ、高エステラーゼ活性によりCa 2 +の敏感な、膜不浸透性のCa 2 +指示薬複合体（Fluo5N/Ca 2 +）に変換されます、34。方法はSERCA 17の遮断後にインスタンスに対して直接"リークチャネル"を介して、代謝、プリンまたはグルタミン酸受容体8,34を介して、例えばIICR-経路を介して、小胞体のカルシウム放出を調査し、ERカルシウム枯渇を可視化するために特に便利です、34。我々の経験に低親和性のCa 2 +指示薬Fluo5N-AMは、現在TED染料ローディング戦略で使用する利用可能な最善の指標である。 Fluo5N-AMは、Ca 2 +のための低親和性を持っている（解離定数K D〜90μM、 図2）、ほぼ非蛍光そのAM-形であるが、calciu際高い蛍光発光を提供していますMバインディング8,34。 Fluo5N/Ca 2 +錯体は、そのようなFITC、アレクサ488、またはeGFPのような標準的な染料に対応〜490ナノメートルの標準光源で励起することができる。細胞質カルシウム信号は殆ど低μMの範囲の濃度に到達しない為、ほとんど細胞質内Fluo5N 35によって検出される。
TEDのパフォーマンスを向上させるには、いくつかの組換えベクター構築物（ 図3）を開発した。もともと、CES2のコード配列（のRefSeqアクセッション番号NM_145603、CES2c）と最高のTEDのパフォーマンスに基づいてTEDベクトルはCES構築物の安定発現で観察されています。新しいTEDベクターは、赤色蛍光タンパク質TagRFP-T2 36に融合CES2のコア要素を表現する。これらのベクターは、それらが形質導入細胞識別し、Fluo5N/Ca 2の変化を正規化するための内部コントロールとして赤色蛍光を使用するために使用することができるという利点を有し+蛍光。赤色蛍光はまた刺激条件でERとERダイナミクスの変化の構造分布を可視化する可能性を提供しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
TED方法の利点と欠点は、最近の刊行物34,35で広く議論されている。上述した他の方法に比べて、TEDは、細胞を破砕し、灌流の問題を回避する。さらに、二つの側面が強調される必要がある。 ERカルシウムイメージングのためのTEDの原理はTEDベクター構築の助けとの低親和性合成AM-エステルの（2）効率的かつ優先的なリリースで、ERの内腔に積極的にカルボキシルエステラーゼの（1）?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、ドイツ学術振興（DFG）BL567/3-1とフリードリヒ·バウアー·財団の補助金によって支えられてきた。我々は、Tag-RFP-T2を私達に提供するためロジャーY.ツィン、カリフォルニア大学サンディエゴ校ハワードヒューズ医学研究所研究所に感謝したいと思います。私たちは、ありがたいことに私たちにレンチウイルスプラスミドFUGWを提供し、psPAX2/pMD2.Gためデイヴィッドボルティモア、カリフォルニア工科大学、パサデナ、そしてディディエTrono、ジュネーブ、ジュネーブ、大学を認める。
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| (S)-3,5-DHPG (Dihydroxyphenylglycine) | Tocris | 0805 | |
| 5′;-ATP-Na2, ATP disodium salt hydrate | Sigma | A26209-1G | |
| B-27 supplement,50x | Invitrogen | 17504-044 | |
| Carbamoylcholine chloride (Charbachol) | Sigma | C4382-1g | |
| Cyclopiazonic acid (CPA) | Ascent scientific | Asc-300 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| DMEM with Glutamax | Invitrogen-Gibco | 31966-047 | |
| Dulbecco’s PBS without Ca/Mg 1x | PAA | H15-002 | |
| Fetal calf serum | Invitrogen-Gibco | 10270-106 | |
| Fluo-5N-AM, 10 x 50 μg | Invitrogen | F14204 | |
| Glutamate | Ascent scientific | Asc-049 | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-038 | |
| Ham’s F12 nutrients mixture | Invitrogen-Gibco | 21765-029 | |
| Hank’s BSS(1x) without Ca,without Mg, with Phenol Red, HBSS | PAA Laboratories | H15-010 | |
| Horse serum | SHD3250YK | Linearis | |
| Ionomycin Ca2+ salt | Ascent scientific | Asc-116 | |
| murine EGF | PreproTech | 315-09 | |
| N2 supplement 100x | Invitrogen | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Invitrogen-Gibco | 21103-049 | |
| Pluronic F127, low UV absorbance,2g | Invitrogen | P6867 | |
| Poly-DL-ornithine hydrobromide PORN | Sigma | P8638 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7280 | |
| Poly-L-Lysin | Sigma | P2636 | |
| Thapsigargin | Calbiochem | 586005-1mg | |
| TryLE Express | Invitrogen | 12605-028 | |
| Trypsin | Worthington | LS-003707 | |
| Trypsininhibitor from Glycine MAX (soybean) | Sigma | T6522 | |
| Materials | |||
| Confocal system: inverted laser scanning microscope: FV1000 with IX81 | Olympus | user-specific configuration | |
| Confocal system: laser combiner FV10 and diode lasers (405, 473, 559, 635) | Olympus | user-specific configuration | |
| Confocal system: scan head FV10-SPD with spectraldetector | Olympus | user-specific configuration | |
| Heater controller TC-344B | Warner Instruments | 64-0101 | to control in line solution heater |
| NIH ImageJ software | WS Rasband, ImageJ, US National Institutes of Health, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997–2006 | ||
| Objective: UAPON20XW340 NA 0,7 WD 0,35 | Olympus | N2709100 | |
| Objective: UPLFLN40XO | Olympus | N1478700 | |
| Objective: UPLSAPO60XO/1.35, WD=0.15 | Olympus | N1480700 | |
| Perfusion chamber, inverse | custom-made | ||
| Perfusion chamber, RC-49FS | Warner Instruments | W4 64-1709 | |
| Perfusion tube: PT-49 | Warner Instruments | 64-1730 | for perfusion |
| Peristaltic pump MiniPlus 3 (4 channels) | Gilson | n.a. | perfusion pump |
| Single inline solution heater SH-27B | Warner Instruments | 64-0102 | controlled by heater controller |
| Suction tubes: ST3R | Warner Instruments | 64-1407 | for perfusion |
| Heating insert: Tempocontrol 37-2 digital 2-channel | Pecon | n.a. |
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