Прямое изображение ЭР кальция с целевыми-эстеразы Индуцированные красителем (TED)

Summary

Целевые-эстеразы индуцированного красителем (TED) поддерживает анализ внутриклеточной динамики магазин кальций флуоресцентной визуализации. Метод основан на нацеливание рекомбинантного карбоксилэстеразы в эндоплазматический ретикулум (ER), где она улучшает местный разоблачении синтетический низким сродством Са^{2 +} Индикатор красителей в ER просвет.

Abstract

Визуализация динамики кальция важно понимать роль кальция в физиологии клетки. Для изучения динамики кальция, синтетический флуоресцентного Са ^{2 +} индикаторов стали популярными. Здесь показано, TED (= целевых-эстеразы индуцированного красителем), способ улучшить высвобождение Са ^{2 +} индикатор красителей в просвете ER из различных типов клеток. На сегодняшний день TED был использован в клеточных линиях, глиальные клетки, и нейронов в пробирке. TED баз на эффективную, рекомбинантные адресности высокой активностью карбоксилэстеразы в просвете ER использованием векторной конструкции, которые выражают карбоксилэстеразы (CES). Последнее TED векторы содержат основной элемент CES2 слит с красным флуоресцентным белком, что позволяет одновременное двухцветные изображения. Динамика свободного кальция в ЭР в образ будут включены в один цвет, а соответствующие структуры ER отображается красным цветом. В начале процедуры клеток, трансдуцированных лентивирусов. Затем инфицированные клеткиRe высевали на покровные, наконец, позволить изображений живых клеток. Затем живые клетки инкубируют с ацетоксиметил эфир (AM-эфир) формы с низким сродством Са ^{2 +} показателей, например Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM или Mag-Fura2-AM. Эстеразы деятельности в расщепляет ER от гидрофобных боковых цепей от AM форме Са ^{2 +} индикатор и гидрофильные флуоресцентного красителя / Ca ^{2 +} образуется комплекс и захваченных в ЭР просвет. После загрузки краситель, клетки анализируют на перевернутой конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. Клетки постоянно озарен Ringer-подобные решения и ER динамики кальция непосредственно визуализируется в заданный промежуток времени. Кальций освобождение от ER идентифицируется снижение интенсивности флуоресценции в регионах, представляющих интерес, в то время заправки из магазина кальция ER приводит к увеличению интенсивности флуоресценции. Наконец, изменение интенсивности флуоресценции во времени определяется путем расчета f / F _0.

Introduction

Чтобы решить физиологические реакции кальция ER, мы разработали новую стратегию для улучшения захвата синтетических красителей чувствительной к кальцию в ЭР. Метод позволяет напрямую, без прерывания мониторинга в реальном времени свободного кальция ER в присутствии внеклеточного кальция.

Функции и сигнализации ER Кальций

Кальций сигналы находятся в разных типах клеток, например мышечных клетках, нейроны и глиальные клетки и их функции в диапазоне от посреднических сокращения мышц к участию в синаптической передаче в обучении и памяти ^1,2. Изменение концентрации свободного кальция высокой научный интерес, так как кальций участвует в регуляции транскрипции генов, пролиферацию клеток, возбудимость нейронов, гибель клеток и других клеточных сигнальных событий ^1-7. Все эти сигналы сотовой кальция функционально связаны и способствуют внутриклеточного кальциямагазин динамики ^8-10.

Общей особенностью всех кальций сигналов поток кальция между внеклеточным пространством, в цитозоль и органелл, в основном ER и митохондрии. Это вызывает динамическое изменение концентрации кальция в эти органеллы, которые воспринимаются различные компоненты сигнализации. В общем, концентрации кальция в ЭР в диапазоне от 100 до 800 мкМ, в цитозоле концентрации кальция близка к 100 нМ, и во внеклеточном пространстве концентрация составляет около 1-2 мм. Соответственно, существует высокая движущая сила химической кальция течь к цитозоле ^2,9,10.

Наиболее широко исследованы ЭР-производных сигналов кальция зависит от стимуляции G-белками рецепторы (GPCR), которые затем активируют фосфолипазу С (PLC). PLC в свою очередь производит инозитол 1,4,5-трифосфата (IP ₃₎ ^1. После связывания IP ₃ до своей RECeptor (IP _3-Rec, рис. 1) в ЭР-мембраны, ионы кальция высвобождаются из просвета ER. Исторически сложилось так, IP _{3-опосредованное} высвобождение кальция из ER был первым – даже хотя и косвенно – измеряется в ацинарных клеток поджелудочной железы по Streb и др. в 1983 году ^11.. В этой публикации предложено в первый раз сигнальный каскад с участием ацетилхолина, фосфолипазы С и _IP-3. Таким образом, высвобождения кальция обычно называют IP _{3-индуцированный} выброс кальция (IiCR) (рис. 1). Киназы-зависимую активацию фосфолипазы сг на рецептор тирозин киназ ссылки действие факторов роста и нейротрофических факторов ER кальциевой сигнализации после IP ₃ высоты ^12. В дополнение к IiCR, кальций высота может быть опосредовано ионотропную ввод кальций, например, с помощью напряжения закрытого кальциевых каналов (Са _V), и последующего кальций-индуцированного высвобождения кальция (CICR) путем повторного рианодиновыхрецепторов (RyR). IiCR CICR и физиологически связаны с магазина управлением поступления кальция (SOCE). SOCE включает действие СТИМ (стромы взаимодействующих молекул), который предназначен для сигнализации выброс кальция, ER. СТИМ было показано, чтобы стимулировать внеклеточной входа кальция через переходный рецепторный потенциал каналов (ГТО) ^13, Orai кальциевых каналов ¹⁴ и даже напряжения закрытого кальциевых каналов ¹⁵ (рис. 1). Потеря кальция ER динамически спасен действие Sarco-эндоплазматический ретикулум кальций АТФазы (SERCA), который активно насосы кальций обратно в ЭР. Блокирование SERCA с такими препаратами, как тапсигаргин представляет непрерывную потерю кальция ER в цитозольный отсека. Это кальций ER "утечка" вызвано ER внутримембранного пор комплексы, такие как Sec61 белкового комплекса ^16,17 (рис. 1).

В 1998 году опубликовал Berridge модели, "нейрон в модели нейрона", whicч предполагает принцип физиологической роли ER в интеграции нейронов кальцием ^5. Эта модель рассматривает существование непрерывной мембраны ER системы формирования внутриклеточных «образ» мембраны нейронов плазмы ^5. Этот бинарный эукариотических мембранной системы как утверждали, было одним из основных условий для временной и пространственной интеграции быстрых и медленных кальциевых сигналов в нейронах. Кальций сигналы, возникающие или одновременно или последовательно в разных шипами или дендритов одного и того же нейрона присвоено сомы клетки или ядра через ER, где они суммируются ^5,18. Затем их сумма может оказывать действие на возбудимость нейронов, регуляцию транскрипции гена или интеграции сигнальных каскадов. Таким образом, ER поддерживает интеграцию кальций сигналов. Одной из предпосылок этой концепции является непрерывность ER в одной ячейке, которая была претендуют несколько исследований и который был доказан, по крайней мере для сомато-Dendritic районов и короткого расстояния проекции аксональное ^19-21. Есть ли ER непрерывности в течение долгих аксональное прогнозов является предметом дискуссий.

Стратегии для измерения расхода свободного кальция через мембрану ER

Кальций сигналы наиболее часто контролироваться в цитозоле ^22,23. Таким образом, она не может быть легко выделено ли Са ^{2 +} течет в цитозоль из внеклеточной или из внутриклеточных депо ^6,24. Чтобы преодолеть это ограничение, методические стратегии для прямой визуализации кальция ER были разработаны. Таким образом, следующие стратегии используются: (1) ER-целевых генетически модифицированных белков-индикаторов ^25-27 на основе белков низким сродством Са ^{2 +} индикаторы используют биолюминесцентного белка GFP аэкворин или в комбинации с кальцием чувствительного белка.. Эти генетически модифицированные Ca ^{2 +} индикаторы (GECIS) можетбыть направлены на ER с помощью сигнального пептида и активно хранится в ER помощью удержания и извлечения мотива. Общие ER Ca ^{2 +} индикаторы базы по принципу Cameleon и Cameleon YC4.3 ^26,28; Cameleon раскол YC7.3ER ²⁹ и Cameleon D1 ^30. (2) Прямая эстераза основе красителя АМ-эфира низкоаффинными Ca ^{2 + 31,32} показателей. AM-производных индикаторов красителей (Mag-Fura2-AM, Mag-Fluo4-AM или Fluo5N-AM) проходят биологические мембраны в липофильном, кальция-нечувствительными государства. Затем в цитозоле, а также в ЭР, эндогенные эстераз расщепляют на АМ-эфирной группы и отпустить Са ^{2 +} индикатор, оставляя за определенное количество активного красителя в цитозоле и в ЭР. Таким образом, этот подход полезен в условиях высокой концентрации кальция в ЭР тех пор, пока концентрация цитозольного кальция остается значительно ниже дезащита предел низким сродством показателей, в частности, во время характерные сигналы кальция (например нМ до низкого мкМ). (3) AM-эфир нагрузки в сочетании с плазматической мембраной проницаемости ^32. Любой оставшийся цитозольного Ca2 ⁺ индикатор удаляется плазматической мембраны проницаемости с небольшим количеством «мягкий» моющего средства (например, сапонин) в искусственной внутриклеточный буфера. Таким образом, внутриклеточных мембран можно стимулировать, например, с _IP-3 внутриклеточной буфер, непосредственно через «поры» в плазматической мембране. (4) Диализ цитозоле при цельноклеточной конфигурации и одновременное измерение Са ^{2 +} в просвете ER и цитозоле ^32,33. Клетки сначала загружается с низким сродством Са ^{2 +} индикатор (например, Mag-Fura2- AM, радиометрический, УФ-светом). Затем с помощью пипетки патч, оставшиеся цитosolic низким сродством Са ^{2 +} индикатор диализу из цитозоле буфером, содержащим высокое сродство Са ^{2 +} индикатор (например, Fluo-3, видимый свет). Такая стратегия позволяет одновременную запись и цитозольные ER полученных сигналов. (5) Целевые эстеразы-индуцированной красителем ^8,34. Карбоксилэстеразы (CES) предназначен для просвете ER и обеспечивает высокую активность эстеразы для эффективного захвата АМ-форме сложного эфира с низким сродством Са ^{2 +} показателей.

Целевые эстеразы-индуцированной красителем (TED)

Для повышения адресности с низким сродством Ca ^{2 +} показатели ER просвет, Тед был разработан. TED требует избыточной экспрессии ER целевых мышь карбоксилэстеразы (CES2) (рис. 2), которая достигается с помощью экспрессионных конструкций. Клетки, экспрессирующие рекомбинантный CES-конструкцию инкубируют с АМ-сложноэфирной формы кальцияиндикатором красителя (Fluo5N-AM, рисунок 2). Затем в ER, краситель превращается в Са ^{2 +} чувствительным, непроницаемой мембраны Са ^{2 +} индикатор комплекс (Fluo5N/Ca ^{2 +)} на высокую активность эстеразы, поэтому захвата красителя в высокой концентрации в просвете ER ^{8 , 34.} Этот метод особенно полезен для исследования ER кальцием высвобождение через IiCR-путей, например, с помощью метаботропного, пуринергической или глутаматных рецепторов, ^8,34 и визуализировать ER кальция истощения через "утечки каналы" непосредственно, например, после блокады SERCA ^{17 , 34.} Нашему опыту низкоаффинными Ca ^{2 +} индикатор Fluo5N-AM в настоящее время является лучшим индикатором доступны для использования с загрузкой стратегии TED красителя. Fluo5N-AM имеет низкий сродство к Са ^{2 +} (константа диссоциации K _D ~ 90 мкм, рисунок 2), почти не флуоресцентные в AM-форме, но обеспечивает высокую флуоресценцию излучения при Calciuм ^8,34 обязательными. Fluo5N/Ca ^{2 +} комплекс может возбуждаться с помощью стандартного источника света ~ 490 нм, что соответствует стандартным красители, такие как FITC, Alexa 488 или УЗФБ. Цитозольного сигнала кальций едва ли достичь концентрации в диапазоне низких мкМ и, следовательно, едва обнаружено Fluo5N в цитозоле ^35.

Чтобы повысить производительность Тед, несколько рекомбинантных векторных конструкций были разработаны (рис. 3). Первоначально, Тед векторы на основе кодирующей последовательности CES2 (RefSeq инвентарным номером NM_145603, CES2c) и лучший TED производительности наблюдается при стабильной экспрессии конструкций ЕЭП. Новые векторы TED выразить одним из основных элементов CES2 слит с красной флуоресценции белков TagRFP-T2 ^36. Эти векторы имеют то преимущество, что они могут быть использованы для идентификации трансдуцированных клеток, а также использовать красную флуоресценцию в качестве внутреннего контроля для нормализации изменений в Fluo5N/Ca ^{2 +} флуоресценции. Красной флуоресценции также дает возможность визуализировать структурные распределение ER и изменения в ER динамики при стимуляции условий.

Protocol

Этот протокол представляет TED применяется к клеточных линиях, нейронах гиппокампа и кортикальных глиальных клеток. TED производительность лучше всего, когда TED векторов стабильно экспрессируются, например, путем лентивирусов векторов. Схематический обзор метода TED показано на рису…

Representative Results

Этот протокол обеспечивает без прерывания подход для прямой визуализации свободного кальция ER. Низкоаффинными синтетического Ca 2 + индикаторы выходят в свет и захваченных в просвете ER с помощью ER целевых, рекомбинантные активность фермента эстеразы. Улучшение загрузки Са 2 +</su…

Discussion

Преимущества и недостатки метода TED широко обсуждалась в последних публикациях ^34,35. По сравнению с другими методами, описанными выше, TED обходит проблему срыва и перфузии клеток. Кроме того, два аспекта необходимо уделять особое внимание. Принцип TED для ER кальций изображений требу?…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalogue Number	Comments
(S)-3,5-DHPG (Dihydroxyphenylglycine)	Tocris	0805
5′;-ATP-Na2, ATP disodium salt hydrate	Sigma	A26209-1G
B-27 supplement,50x	Invitrogen	17504-044
Carbamoylcholine chloride (Charbachol)	Sigma	C4382-1g
Cyclopiazonic acid (CPA)	Ascent scientific	Asc-300
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650
DMEM with Glutamax	Invitrogen-Gibco	31966-047
Dulbecco’s PBS without Ca/Mg 1x	PAA	H15-002
Fetal calf serum	Invitrogen-Gibco	10270-106
Fluo-5N-AM, 10 x 50 μg	Invitrogen	F14204
Glutamate	Ascent scientific	Asc-049
Glutamax	Invitrogen	35050-038
Ham’s F12 nutrients mixture	Invitrogen-Gibco	21765-029
Hank’s BSS(1x) without Ca,without Mg, with Phenol Red, HBSS	PAA Laboratories	H15-010
Horse serum	SHD3250YK	Linearis
Ionomycin Ca2+ salt	Ascent scientific	Asc-116
murine EGF	PreproTech	315-09
N2 supplement 100x	Invitrogen	17502-048
Neurobasal medium	Invitrogen-Gibco	21103-049
Pluronic F127, low UV absorbance,2g	Invitrogen	P6867
Poly-DL-ornithine hydrobromide PORN	Sigma	P8638
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma	P7280
Poly-L-Lysin	Sigma	P2636
Thapsigargin	Calbiochem	586005-1mg
TryLE Express	Invitrogen	12605-028
Trypsin	Worthington	LS-003707
Trypsininhibitor from Glycine MAX (soybean)	Sigma	T6522
			Materials
Confocal system: inverted laser scanning microscope: FV1000 with IX81	Olympus		user-specific configuration
Confocal system: laser combiner FV10 and diode lasers (405, 473, 559, 635)	Olympus		user-specific configuration
Confocal system: scan head FV10-SPD with spectraldetector	Olympus		user-specific configuration
Heater controller TC-344B	Warner Instruments	64-0101	to control in line solution heater
NIH ImageJ software	WS Rasband, ImageJ, US National Institutes of Health, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997–2006
Objective: UAPON20XW340 NA 0,7 WD 0,35	Olympus	N2709100
Objective: UPLFLN40XO	Olympus	N1478700
Objective: UPLSAPO60XO/1.35, WD=0.15	Olympus	N1480700
Perfusion chamber, inverse	custom-made
Perfusion chamber, RC-49FS	Warner Instruments	W4 64-1709
Perfusion tube: PT-49	Warner Instruments	64-1730	for perfusion
Peristaltic pump MiniPlus 3 (4 channels)	Gilson	n.a.	perfusion pump
Single inline solution heater SH-27B	Warner Instruments	64-0102	controlled by heater controller
Suction tubes: ST3R	Warner Instruments	64-1407	for perfusion
Heating insert: Tempocontrol 37-2 digital 2-channel	Pecon	n.a.