وهناك طريقة للماوس البنكرياس جزيرة العزلة وبين الخلايا المخيم تقدير
Summary
يعاير في المختبر وظيفة β-الخلية باستخدام الماوس الجزر المعزولة لانجرهانز هو عنصر هام في دراسة الفيزيولوجيا المرضية السكري والعلاجات. في حين أن العديد من التطبيقات المتاحة المصب، ويصف هذا البروتوكول على وجه التحديد قياس الخلايا أحادي فسفات الأدينوزين الحلقي (المخيم) كمعلمة أساسية تحديد وظيفة خلايا β.
Abstract
سكر الدم غير المنضبط هو السمة المميزة لمرض السكري ويعزز حالة مرضية مختلفة مثل اعتلال الأعصاب، اعتلال الكلية، واعتلال الشبكية. مع الانتشار المتزايد لمرض السكري، وكلاهما مناعية من نوع 1 ونوع 2 المرتبط بالسمنة، والدراسات التي تهدف إلى ترسيم الفيزيولوجيا المرضية السكري والآليات العلاجية هي ذات أهمية حاسمة. الخلايا β لجزر لانجرهانز في البنكرياس المسؤولة عن إفراز الأنسولين بشكل مناسب في استجابة لتركيزات السكر في الدم مرتفعة. بالإضافة إلى الجلوكوز والمواد المغذية الأخرى، يتم تحفيز خلايا β أيضا هرمونات محددة، ووصف incretins، والتي تفرز من الأمعاء ردا على وجبة والعمل على مستقبلات خلايا β التي تزيد من إنتاج الخلايا أحادي فسفات الأدينوزين الحلقي ( المخيم). انخفاض وظيفة الخلايا β-، الشامل، والاستجابة incretin هي مفهومة جيدا للمساهمة في الفيزيولوجيا المرضية لمرض السكري من النوع 2، ويجري أيضا مرتبطة على نحو متزايد وايال داء السكري نوع 1. الماوس الحاضر جزيرة العزلة ومخيم بروتوكول تقرير يمكن أن يكون أداة للمساعدة في ترسيم آليات تعزيز تطور المرض والتدخلات العلاجية، وخاصة تلك التي يتم بوساطة المستقبلات incretin أو المستقبلات التي تعمل من خلال تعديل الإنتاج المخيم الخلايا ذات الصلة. في حين سيتم وصفها القياسات المخيم فقط، بروتوكول جزيرة العزلة وصفها يخلق إعداد النظيفة التي تسمح أيضا للعديد من التطبيقات المصب الأخرى، بما في ذلك الجلوكوز حفز افراز الانسولين، [3 H] ثيميدين-التأسيس، وفرة البروتين، والتعبير مرنا.
Introduction
صيانة صارمة من سوائية سكر الدم أمر حتمي لمنع حالة مرضية مختلفة مثل اعتلال الأعصاب، اعتلال الكلية، واعتلال الشبكية، وهي كلها بصمات علم الأمراض من نوع غير المنضبط 1 و 2 من مرض السكري 1. انخفاض وظيفة الخلايا β والشامل في كل نوع 1 و 2 من مرض السكري التشويش على تركيز الجلوكوز في الدم 2. في حين أن نوع مناعية 1 نتائج مرض السكري من خسارة مدمرة لخلايا β-المنتجة للانسولين، وضعف إفراز الأنسولين خلايا β وإشارات الأنسولين الطرفية في مرض السكري من النوع 2 معا تعزيز ارتفاع السكر في الدم، دسليبيدميا، وزيادة إنتاج الجلوكوز في الكبد، مما يؤدي في نهاية المطاف في كلا فقدان القدرة كتلة خلايا β والانسولين إفرازية من فرد خلايا β 3. وفهم آليات خلايا β الكامنة في تطور النوع 2 من مرض السكري 1 و إعطاء أمل يؤدي إلى علاجات جديدة لمنع وعلاج هذه الأمراض.
منظمة الشفافية الدولية في المختبرنماذج الثقافة ssue، مثل INS-1 وMIN6 خلد خطوط الخلايا β-، يمكن أن تكون أدوات مفيدة لفهم وظائف الخلايا β محددة. ومع ذلك، فإن التفاعلات بين أنواع مختلفة من الخلايا داخل جزيرة أنفسهم قد تنظم وظيفة الخلية β. على سبيل المثال، تأثير نظير الصماوي من الجلوكاجون (أفرج عنه من الخلايا α) والسوماتوستاتين (أفرج عنه من الخلايا δ) في زيادة وخفض إفراز الأنسولين، على التوالي، يدل على أهمية القرب خلية خلية في استجابة الغدد الصماء 4. علاوة على ذلك، تقاطعات الفجوة بين خلايا β تحفيز الافراج عن الانسولين 5. علاوة على ذلك، رغم ما اتخذ من خطوات في توليد خطوط ورم جزيري أن تكرارها بشكل أفضل الاستجابة الفسيولوجية من الجزر المعزولة إلى جلوكوز (على سبيل المثال، INS-1-مشتقة 832/13 و832/3 خطوط الخلايا)، والاستجابة الجلوكوز لا يزال يختلف من الفئران العادية الجزر 6،7. وعلاوة على ذلك، واستجابة لهذه خطوط الخلايا ورم جزيري النسيليلالببتيد-1 (GLP-1) منبهات مثل الجلوكاجون يمكن أن تختلف بشكل كبير عن بعضها البعض، وكذلك من الجزر الطبيعية 6. وبالتالي، خطوط الخلايا خلد قد لا تمثل أفضل نموذج لمعايرة العوامل التي تؤثر على إنتاج المخيم.
وعلى النقيض من خطوط الخلايا المشتقة من ورم جزيري، ودراسة وظيفة خلايا β فقط في النماذج الحيوانية كلها تقدم مجموعتها الخاصة من المضاعفات. واحدة من أكبر التحديات في العمل مع أنسجة الغدد الصماء وقياس تركيز دقيق لهرمون يفرزه الجسم. على وجه التحديد، والكبد يلعب دورا رئيسيا تأييض الأنسولين، وتدفق الدم البنكرياس يذهب مباشرة إلى الكبد. وهكذا، فإن قياس الانسولين البلازما قد لا تصور بدقة كميات الأنسولين التي يفرزها البنكرياس من نفسه أو تأثير العلاجات المختلفة على معدل إفراز الأنسولين 8. وعلاوة على ذلك، والتمثيل الغذائي الكلوي من الجلوكاجون قد تحد من الاعتماد على الانتاج الجلوكاجون من خلايا جزيرة α 9. لذلك، عزل الجزر الماوس الأساسي للالتجريب في المختبر يوفر فهما أكثر دقة عن كيفية جزيرة يستجيب للمؤثرات محددة لاستكمال القياسات التي أجريت في الجسم الحي.
هذا البروتوكول لعزل الجزر الماوس هو بروتوكول الراسخة التي يستخدمها عدد من المجموعات (مع بعض التعديلات الطفيفة التي قد تساعد على زيادة النجاح) 10،11. بالإضافة إلى ذلك، تحديد الإنتاج المخيم يسمح لقراءة المغادرة مباشرة للاستجابة incretin للخلايا β. بالتزامن مع قياس المخيم، ومحتوى البروتين إفراز الأنسولين كما يمكن كميا من نفس العينة المخيم الإعدادية، مما يساعد على تحديد ما إذا كان وجود خلل في وظيفة خلايا β يكمن الداني القاصي أو إلى معسكر 10. المحتوى المخيم النهائية وتطبيق إفراز الأنسولين في هذا البروتوكول يمكن أن يكون أداة قوية جدا لفهم تأثير المكونات الدوائية والغذائية، من بين أمور أخرىق، في المخيم وإفراز الأنسولين. بالإضافة إلى التحفيز من الجلوكوز وحده، ومركبات أخرى يمكن استخدامها لقياس التغيرات في المخيم وافراز الانسولين 10،11.
أخيرا، على الرغم من أن الأنسولين هو الهرمون الأساسي أننا مقايسة من الجزر المعزولة، والهرمونات الأخرى، مثل الجلوكاجون والسوماتوستاتين، فضلا عن السيتوكينات، eicosanoids، وأحادي فسفات الأدينوزين الحلقي، ويمكن أيضا أن تقاس، إما عن طريق تحفيز مقايسة عابرة أو عن طريق التحديد الكمي لل مستوياتها في مستنبت 12. أخيرا، على الرغم من خارج نطاق هذه المخطوطة، والعزلة جزيرة مع أسلوب كولاجيناز العزلة وصفها يسمح للحفاظ على جزيرة بحيث يمكن السعي العديد من التطبيقات المصب الأخرى، مثل زرع جزيرة، عزل الحمض النووي الريبي في الوقت الحقيقي PCR الكمي أو ميكروأري التحليلات، البروتين العزلة عن النشاف الغربية، جزيرة التضمين والتصوير مناعي، وإدماج [3H]-ثيميدين كمقياس للrepli خلايا الجزيرةالموجبة، وبعضها قد تم وصفها في مقالات سابقة إن الرب 13-16. عموما، بعد إجراء العزل جزيرة موضح في البروتوكول قد توفر الباحث بمعلومات هامة ومفيدة لتطوير علاجات وتشجيع اكتشاف المخدرات التي تهدف إلى تعزيز وظيفة خلايا β.
Protocol
Representative Results
Discussion
مع انتشار مرض السكري من المتوقع أن تؤثر على 7.7٪ من سكان العالم، واشتراط تقنيات البحث الرواية لا بد من فهم كل من وعلاج مرض السكري 18. عزلة جزيرة الحاضر هو بروتوكول راسخة المستخدمة في المختبر لالتجريب وقدمت من قبل مع تعديلات طفيفة 11،14،16. على الرغم من إفرا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر رينيه L. Pasker وHarpreet K. برار للحصول على المساعدة التقنية للخبراء بشأن البروتوكولات وصفها في هذا العمل. وعلاوة على ذلك، نود أن نعترف التوجيه كريستوفر B. Newgard في جامعة ديوك وألان D. Attie في جامعة ويسكونسن ماديسون، جنبا إلى جنب مع دعم أعضاء المختبر، والتي سمح لنا الوقت والدعم اللازم لتحسين البروتوكولات وصفها. على وجه الخصوص، ونحن نشكر هانز Hohmeier، Danhong لو، وهيلينا وينفيلد في مختبر Newgard ومريم Rabaglia في مختبر Attie لمناقشات مثمرة والمشورة. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح DK080845 وسكري الأطفال 594
منحة مؤسسة البحوث 17-2011-608 (لمجاهدي خلق)
Materials
| Collagenase: Collagenase from Clostridium histolyticum suitable for isolating active islets | Sigma-Aldrich | C7657 |
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F9378 |
| Hanks Balanced Salt Solution 10X | Invitrogen (Gibco) | 14065-056 |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 |
| RPMI 1640 (powder) | Invitrogen (Gibco) | 31800-022 |
| Albumin from Bovine Serum (BSA) | Sigma-Aldrich | A7888 |
| 3/0 Silk Suture Thread | Fine Science Tools | 18020-30 |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 |
| 0.8 mm Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 |
| Curved Scissors | Fine Science Tools | 14061-10 |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors – Straight/Sharp/8.5 cm/5 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15003-08 |
| Dissecting Scissors | Fine Science Tools | 14002-14 |
| 5ml BD Luer-Lok Syringe | BD | 309646 |
| 1ml BD syringe | BD | 309628 |
| 30 G BD Needle 1/2" Length | BD | 305106 |
| 27 G BD Needle 1/2" Length | BD | 305109 |
| Sharpening Stone | Fine Science Tools | 29008-01 |
| 2-2-2 tribromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402-25G |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 240486-100mL |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 |
| Monopotassium Phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P0662 |
| Sodium Bicarbonate (NaCHO3) | Sigma-Aldrich | S6014 |
| CaCl2 *2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 |
| MgSO4 *7H2O | Sigma-Aldrich | M9397 |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen (Gibco) | 15140-122 |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum (H.I. FBS) | Fisher Scientific | SH30088.03HI |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma-Aldrich | 5879-100MG |
References
- Cryer, P. E. Hypoglycaemia: the limiting factor in the glycaemic management of Type I and Type II diabetes. Diabetologia. 45, 937-948 (2002).
- Alberti, K. G., Zimmet, P. Z. Definition, diagnosis and classification of diabetes mellitus and its complications. Part 1: diagnosis and classification of diabetes mellitus provisional report of a WHO consultation. Diabet Med. 15, 539-553 (1998).
- Muoio, D. M., Newgard, C. B. Mechanisms of disease: molecular and metabolic mechanisms of insulin resistance and beta-cell failure in type 2 diabetes. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 193-205 (2008).
- Kelly, C., McClenaghan, N. H., Flatt, P. R. Role of islet structure and cellular interactions in the control of insulin secretion. Islets. 3, 41-47 (2011).
- Meda, P., Halban, P., Perrelet, A., Renold, A. E., Orci, L. Gap junction development is correlated with insulin content in the pancreatic B cell. Science. 209, 1026-1028 (1980).
- Hohmeier, H. E., et al. Isolation of INS-1-derived cell lines with robust ATP-sensitive K+ channel-dependent and -independent glucose-stimulated insulin secretion. Diabetes. 49, 424-430 (2000).
- Hohmeier, H. E., Newgard, C. B. Cell lines derived from pancreatic islets. Mol Cell Endocrinol. 228, 121-128 (2004).
- Field, J. B. Extraction of insulin by liver. Annu Rev Med. 24, 309-314 (1973).
- Emmanouel, D. S., et al. Glucagon metabolism in the rat. J Clin Invest. 62, 6-13 (1978).
- Kimple, M. E., et al. Deletion of GalphaZ protein protects against diet-induced glucose intolerance via expansion of beta-cell mass. J Biol Chem. 287, 20344-20355 (2012).
- Rabaglia, M. E., et al. Alpha-Ketoisocaproate-induced hypersecretion of insulin by islets from diabetes-susceptible mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 289, 218-224 (2005).
- Collins, S. C., Salehi, A., Eliasson, L., Olofsson, C. S., Rorsman, P. Long-term exposure of mouse pancreatic islets to oleate or palmitate results in reduced glucose induced somatostatin and oversecretion of glucagon. Diabetologia. 51, 1689-1693 (2008).
- Fueger, P. T., Hernandez, A. M., Chen, Y. C., Colvin, E. S. Assessing Replication and Beta Cell Function in Adenovirally-transduced Isolated Rodent Islets. J Vis Exp. , (2012).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. J Vis Exp. , (2007).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Transplantation of pancreatic islets into the kidney capsule of diabetic mice. J Vis Exp. , (2007).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. J Vis Exp. , (2011).
- Kimple, M. E., et al. A role for G(z) in pancreatic islet beta-cell biology. J Biol Chem. 280, 31708-31713 (2005).
- Shaw, J. E., Sicree, R. A., Zimmet, P. Z. Global estimates of the prevalence of diabetes for 2010 and 2030. Diabetes Res Clin Pract. 87, 4-14 (2010).
- Kirstetter, P., Lagneau, F., Lucas, O., Krupa, Y., Marty, J. Role of endothelium in the modulation of isoflurane-induced vasodilatation in rat thoracic aorta. Br J Anaesth. 79, 84-87 (1997).
- Brown, E. T., Umino, Y., Loi, T., Solessio, E., Barlow, R. Anesthesia can cause sustained hyperglycemia in C57/BL6J mice. Vis Neurosci. 22, 615-618 (2005).
- Vaupel, D. B., McCoun, D., Cone, E. J. Phencyclidine analogs and precursors: rotarod and lethal dose studies in the mouse. J Pharmacol Exp Ther. 230, 20-27 (1984).
- Davis, D. B., et al. FoxM1 is up-regulated by obesity and stimulates beta-cell proliferation. Mol Endocrinol. 24, 1822-1834 (2010).
- Dionne, K. E., Colton, C. K., Yarmush, M. L. Effect of hypoxia on insulin secretion by isolated rat and canine islets of Langerhans. Diabetes. 42, 12-21 (1993).
- Linetsky, E., et al. Improved human islet isolation using a new enzyme blend, liberase. Diabetes. 46, 1120-1123 (1997).
- Vaithilingam, V., Sundaram, G., Tuch, B. E. Islet cell transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 13, 633-638 (2008).
- Brandhorst, H., et al. Large-scale comparison of Liberase HI and collagenase NB1 utilized for human islet isolation. Cell Transplant. 19, 3-8 (2010).
