Un metodo per l'isolamento del mouse isole pancreatiche e intracellulare cAMP Determinazione
Summary
Saggio funzione in vitro β-cellulare utilizzando isolate del mouse isole di Langerhans è una componente importante nello studio della fisiopatologia del diabete e terapeutica. Mentre molte applicazioni a valle sono disponibili, questo protocollo descrive specificamente la misurazione di intracellulare adenosina monofosfato ciclico (cAMP) come parametro essenziale determinare la funzione β-cellulare.
Abstract
La glicemia incontrollata è una caratteristica del diabete mellito e promuove patologie come la neuropatia, nefropatia e retinopatia. Con la crescente prevalenza del diabete, sia immuno-mediata di tipo 1 e obesità legati tipo 2, gli studi volti a delineare fisiopatologia del diabete e dei meccanismi terapeutici sono di importanza critica. I β-cellule delle isole pancreatiche di Langerhans sono responsabili opportunamente secrezione di insulina in risposta a concentrazioni di glucosio nel sangue. Oltre al glucosio e altri nutrienti, i β-cellule sono stimolate dagli ormoni specifici, incretins, che sono secreti dall'intestino in risposta ai pasti e agire sui recettori β-cellule che aumentano la produzione intracellulare di adenosina monofosfato ciclico (definito cAMP). Diminuzione della funzione β-cellulare, massa, e la reattività incretine sono ben compresi, per contribuire alla fisiopatologia del diabete di tipo 2, e sono anche sempre più collegate with diabete di tipo 1. L'attuale topo isolamento delle isole e il protocollo determinazione cAMP possono essere uno strumento per aiutare a delineare i meccanismi che promuovono la progressione della malattia e gli interventi terapeutici, in particolare quelli che sono mediate dai recettori incretine o recettori che agiscono attraverso la modulazione della produzione di cAMP intracellulare legato. Mentre saranno descritte soltanto misurazioni cAMP, il protocollo di isolamento isolotto descritto crea un preparato pulito che consente anche per molte altre applicazioni a valle, come il glucosio stimolata la secrezione di insulina, [3 H]-timidina, proteine abbondanza, e l'espressione di mRNA.
Introduction
La rigorosa manutenzione di euglicemia è indispensabile per evitare morbosità come la neuropatia, nefropatia e retinopatia, che sono tutte caratteristiche della patologia di incontrollata di tipo 1 e 2 il diabete 1. Funzione β-cellulare ridotto e di massa sia di tipo 1 e diabete 2 perturbano le concentrazioni di glucosio nel sangue 2. Considerando che tipo immuno-mediata 1 diabete risultati da una perdita devastante di β-cellule che producono insulina, alterata secrezione di insulina β-cellulare e la segnalazione periferica all'insulina nel diabete di tipo 2 insieme promuovono iperglicemia, dislipidemia, e aumento della produzione epatica di glucosio, che alla fine si traduce in sia la perdita della massa β-cellulare e la secrezione di insulina capacità da singoli β-cellule 3. La comprensione dei meccanismi alla base β-cellule nella progressione di tipo 1 e diabete 2 si spera, darà luogo a nuove terapie per prevenire e curare queste malattie.
In vitro timodelli di coltura SSUE, come l'INS-1 e MIN6 immortalati linee di β-cellule, possono essere strumenti utili per la comprensione delle funzioni β-cellulari specifici. Tuttavia, le interazioni tra i diversi tipi cellulari all'interno isolotto si possono regolare la funzione β-cellulare. Ad esempio, l'influenza paracrina di glucagone (rilasciato da α-cellule) e somatostatina (rilasciato da δ-cellule) in aumentando e diminuendo la secrezione di insulina, rispettivamente, dimostra l'importanza della prossimità cella cella nella risposta endocrina 4. Inoltre, giunzioni gap tra β-cellule potenziano il rilascio di insulina 5. Inoltre, sebbene progressi sono stati fatti nel generare linee insulinoma che meglio replicato la risposta fisiologica di isole isolate al glucosio (ad esempio, l'INS-1-derivato 832/13 e 832/3 linee cellulari), la rispondenza glucosio differenti rispetto ratto normale isolotti 6,7. Inoltre, la risposta di queste linee cellulari clonali insulinomaal peptide-1 (GLP-1) agonisti glucagone-simile possono differire notevolmente l'uno dall'altro, così come da isolotti normali 6. Pertanto, le linee cellulari immortalizzate non possono rappresentare il modello migliore per saggiare gli agenti che hanno un impatto sulla produzione di cAMP.
In contrasto con le linee cellulari derivate insulinoma, studiando funzione β-cellula esclusivamente in modelli animali interi offre una propria serie di complicazioni. Una delle maggiori sfide nel lavoro con tessuto endocrino sta misurando la concentrazione precisa di ormone rilasciato. In particolare, il fegato gioca un ruolo importante metabolizzare insulina, e il pancreas flusso sanguigno va direttamente al fegato. Così, una misura insulinemia non può ritrarre con precisione le quantità di insulina essere secreti dal pancreas stesso o l'impatto di trattamenti diversi sul tasso di secrezione insulinica 8. Inoltre, il metabolismo renale di glucagone può limitare l'affidabilità di uscita glucagone dall'Islet α-cellule 9. Pertanto, isolando isole primari di topo per la sperimentazione in vitro fornisce una comprensione più precisa di come l'isolotto sta rispondendo a stimoli specifici per integrare le misurazioni effettuate in vivo.
Il presente protocollo per l'isolamento di isole di topo è un protocollo ben consolidata utilizzato da un certo numero di gruppi (con lievi modifiche che possono contribuire ad aumentare il successo) 10,11. Inoltre, la determinazione della produzione di cAMP consente una lettura diretta della reattività incretin delle β-cellule. In combinazione con la misurazione cAMP, contenuto proteico e la secrezione di insulina possono anche essere quantificato dal medesimo preparazione del campione cAMP, contribuendo a determinare se un difetto nella funzione β-cellula si trova prossimale o distale di cAMP 10. Il contenuto di cAMP e l'applicazione finale secrezione insulinica in questo protocollo può essere uno strumento molto potente per comprendere l'influenza delle componenti farmaceutici, alimentari, tra l'altros, in cAMP e la secrezione di insulina. Oltre alla stimolazione da solo glucosio, altri composti possono essere utilizzati per misurare le variazioni di cAMP e secrezione insulinica 10,11.
Infine, anche se l'insulina è il principale ormone che saggio da isole isolate, altri ormoni, quali il glucagone e la somatostatina, così come le citochine, eicosanoidi e adenosina monofosfato ciclico, può anche essere misurata, mediante un saggio stimolazione transiente o quantificazione di ai livelli del terreno di coltura 12. Infine, anche se al di fuori del campo di applicazione di questo manoscritto, isolamento delle isole con il metodo di isolamento collagenasi descritto consente per la conservazione isolotto in modo che molte altre applicazioni a valle possono essere perseguiti, come il trapianto di isole, l'isolamento di RNA per quantitativa in tempo reale PCR o microarray analisi, proteine isolamento per Western blotting, isolotto incorporamento e di imaging immunofluorescenza, e l'incorporazione di [3H]-timidina come misura di replicazione delle cellule insularizione, alcuni dei quali sono stati descritti in precedenti articoli JoVE 13-16. Nel complesso, seguendo la procedura di isolamento delle isole descritta nel protocollo può fornire un ricercatore con informazioni importanti e utili per lo sviluppo di terapie e promuovere la scoperta di farmaci volti a migliorare la funzione β-cellulare.
Protocol
Representative Results
Discussion
Con la prevalenza di diabete proiettate a pregiudicare il 7,7% della popolazione mondiale, l'esigenza di nuove tecniche di ricerca è fondamentale sia per capire e curare il diabete 18. L'attuale isolamento delle isole è un protocollo ben consolidata utilizzati per la sperimentazione in vitro ed è stato presentato in precedenza con lievi modifiche 11,14,16. Anche se la secrezione di insulina è un'applicazione a valle comune di isole isolate, concentrandosi su componenti a mo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare Renee L. Pasker e Harpreet K. Brar per l'assistenza tecnica di esperti sui protocolli descritti in questo lavoro. Inoltre, vorremmo riconoscere il mentoring di Christopher B. Newgard alla Duke University e Alan D. Attie presso l'Università del Wisconsin-Madison, con il supporto dei loro membri di laboratorio, che ci ha permesso il tempo e il supporto necessario per ottimizzare l' protocolli descritti. In particolare, ringraziamo Hans HOHMEIER, Danhong Lu, e Helena Winfield nel Laboratorio Newgard e Maria Rabaglia nel Laboratorio Attie per le discussioni produttive e consigli. Questo lavoro è stato sostenuto da NIH DK080845 sovvenzione e Juvenile Diabetes 594
Research Foundation concessione 17-2011-608 (a MEK)
Materials
| Collagenase: Collagenase from Clostridium histolyticum suitable for isolating active islets | Sigma-Aldrich | C7657 |
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F9378 |
| Hanks Balanced Salt Solution 10X | Invitrogen (Gibco) | 14065-056 |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 |
| RPMI 1640 (powder) | Invitrogen (Gibco) | 31800-022 |
| Albumin from Bovine Serum (BSA) | Sigma-Aldrich | A7888 |
| 3/0 Silk Suture Thread | Fine Science Tools | 18020-30 |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 |
| 0.8 mm Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 |
| Curved Scissors | Fine Science Tools | 14061-10 |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors – Straight/Sharp/8.5 cm/5 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15003-08 |
| Dissecting Scissors | Fine Science Tools | 14002-14 |
| 5ml BD Luer-Lok Syringe | BD | 309646 |
| 1ml BD syringe | BD | 309628 |
| 30 G BD Needle 1/2" Length | BD | 305106 |
| 27 G BD Needle 1/2" Length | BD | 305109 |
| Sharpening Stone | Fine Science Tools | 29008-01 |
| 2-2-2 tribromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402-25G |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 240486-100mL |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 |
| Monopotassium Phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P0662 |
| Sodium Bicarbonate (NaCHO3) | Sigma-Aldrich | S6014 |
| CaCl2 *2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 |
| MgSO4 *7H2O | Sigma-Aldrich | M9397 |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen (Gibco) | 15140-122 |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum (H.I. FBS) | Fisher Scientific | SH30088.03HI |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma-Aldrich | 5879-100MG |
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