Метод мышь панкреатических островков изоляции и внутриклеточного цАМФ определения
Summary
Опробование пробирке функцию β-клеток при помощи изолированных островков мыши Лангерганса является важным компонентом в изучении диабета патофизиологии и терапии. Хотя многие вниз по течению приложения доступны, этот протокол конкретно описывает измерение внутриклеточного циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) в качестве важного параметра, определяющего функцию β-клеток.
Abstract
Неконтролируемое гликемии является отличительной чертой сахарного диабета и способствует заболеваемости, как нейропатия, нефропатия, и ретинопатии. В связи с ростом распространенности диабета, как иммуноопосредованной типа 1 и ожирением связаны типа 2, исследований, направленных на разграничении сахарный патофизиологии и терапевтические механизмы имеют решающее значение. В β-клетках панкреатических островках Лангерганса ответственны за соответствующим секретирующих инсулин в ответ на повышение концентрации глюкозы в крови. В дополнение к глюкозе и других питательных веществ, то β-клетки также стимулируется конкретных гормонов, называемых инкретины, которые секретируются в кишечнике в ответ на прием пищи и действуют на β-клеточных рецепторов, которые увеличивают продукцию внутриклеточного циклического аденозинмонофосфата ( цАМФ). Снижение функции β-клеток, масса и инкретин отзывчивость хорошо понимал внести свой вклад в патофизиологии диабета типа 2, и также все чаще связаны Wiй диабет типа 1. Настоящий изоляции островок мыши и протокол определения цАМФ может быть инструментом, чтобы помочь очертить механизмы, способствующие прогрессирования заболевания и терапевтические вмешательства, особенно те, которые опосредованы инкретин рецепторов или связанные рецепторы, которые действуют через модуляцию внутриклеточной продукции цАМФ. В то время как только измерения цАМФ будет описано ниже, описано протокол изоляции островок создает чистый препарат, который также позволяет для многих других последующих применений, в том числе глюкозы стимулировали секрецию инсулина, [3H]-тимидина, белок избытке, и экспрессии мРНК.
Introduction
Строгое соблюдение эугликемии является необходимым условием предотвращения заболевания, такие как невропатия, нефропатия и ретинопатия, которые все признаки патологии неконтролируемого типа 1 и 2 диабета 1. Снижение функции β-клеток и масса в обоих типов 1 и диабета 2 возмущают концентрации глюкозы в крови 2. В то время как иммуноопосредованное типа 1 Результаты диабет от разрушительного потери инсулин-продуцирующие β-клеток, нарушение секреции инсулина β-клеток и периферической сигналов инсулина при диабете 2 типа вместе способствовать гипергликемии, дислипидемии, и увеличение производства печеночная глюкоза, которая в конечном итоге приводит к как потеря массы β-клеток и секреции инсулина мощностью от отдельных β-клеток 3. Понимание основных механизмов β-клеток в прогрессировании типа 1 и диабета 2 мы надеемся привести к новым методам лечения для профилактики и лечения этих заболеваний.
В ти пробиркеSSUE модели культуры, такие как INS-1 и MIN6 увековечены β-клеточных линий, могут быть полезными инструментами для понимания специфические функции β-клеток. Однако взаимодействие между различными типами клеток внутри островка сами могут регулировать функцию β-клеток. Например, паракринная влияние глюкагона (выпущен из α-клеток) и соматостатин (освобожден от δ-клетками) в увеличение и уменьшение секреции инсулина, соответственно, демонстрирует важность близости клетка клеток в эндокринной ответ 4. Кроме того, щелевые контакты между β-клеток усиливать высвобождение инсулина 5. Кроме того, хотя успехи были достигнуты в создании инсулиномы линии, которые лучше воспроизведены физиологическую реакцию изолированных островков в глюкозу (например, INS-1, полученных 832/13 и 832/3 клеточных линий), их отзывчивость глюкозы еще отличается от обычной крысы островков 6,7. Кроме того, реакция этих клональных линий клеток инсулиномына глюкагон-подобный пептид-1 (GLP-1) агонисты могут значительно отличаться друг от друга, а также от нормальных островков 6. Поэтому иммортализованные клеточные линии могут не представлять лучшую модель для опробования агенты, которые влияют на производство цАМФ.
В отличие от инсулиномы-клеточных линиях, изучая функцию β-клеток только в целых животных моделях предлагает свой набор осложнений. Один из самых больших проблем в работе с эндокринной ткани измерения точной концентрации гормона освобождены. В частности, печень играет важную роль метаболизме инсулина, и поток крови поджелудочной железы идет непосредственно в печень. Таким образом, измерение инсулина в плазме не может точно изобразить количество инсулина вырабатывается организмом из самого поджелудочной железы или влиянии различных методов лечения на скорость секреции инсулина 8. Кроме того, метаболизм почек глюкагона может ограничить надежность выход глюкагона из островковых клеток α-9. Таким образом, выделение первичных островки мыши для экспериментов в пробирке обеспечивает более точное понимание того, как островок реагирует на специфические стимулы, чтобы дополнить измерения, сделанные в естественных условиях.
Настоящий протокол для выделения островков мыши является устоявшихся протокол, используемый ряда групп (с небольшими изменениями, которые могут помочь повысить успех) 10,11. Кроме того, определение производства цАМФ обеспечивает прямой считывани инкретин отзывчивости на β-клетки. В сочетании с измерением цАМФ, содержание белка и секреции инсулина также может быть определена количественно с того же образца цАМФ преп, помогает определить, находится ли дефект в функции β-клеток проксимальный или дистальный к цАМФ 10. Конечное содержание цАМФ и секреции инсулина приложение в этом протоколе может быть очень мощным инструментом для понимания влияния фармацевтических и пищевых компонентов, среди прочегос, на цАМФ и секреции инсулина. В дополнение к стимуляции только из глюкозы, другие соединения могут быть использованы для измерения изменений в цАМФ и секреции инсулина 10,11.
Наконец, хотя инсулин является основным гормоном, мы анализа из изолированных островков, других гормонов, таких как глюкагон и соматостатин, а также цитокинов, эйкозаноидов и циклического аденозинмонофосфата, также может быть измерено, либо посредством переходного анализа стимуляции или количественного определения их уровни в культуральной среде 12. Наконец, хотя за рамки этой рукописи, островок изоляции с описанным способом изоляции коллагеназы позволяет для сохранения островков так, что многие другие нижестоящие приложения могут осуществляться, например, трансплантации островков, выделения РНК для количественного ПЦР в реальном времени или микрочипов анализирует, белка изоляция для вестерн-блоттинга, островок вложения и изображения иммунофлуоресцентным и [3Н]-тимидина в качестве меры островковых клеток Repliкатион, некоторые из которых были описаны в предыдущих JOVE статей 13-16. В целом, в соответствии с процедурой выделения островковых клеток, описанный в протоколе может обеспечить исследователя с важной и полезной информации для разработки методов лечения и содействия разработке лекарств, направленных на повышение функции β-клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
С распространением диабета прогнозам, влияют 7,7% населения земного шара, требование новых методов исследования важно, чтобы понимать и лечить диабет 18. Настоящий изоляции Островка устоявшихся протокол, используемый для экспериментов в пробирке и был представлен ранее, с неб…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Рене Л. ПАСКЕР и Harpreet К. BRAR для квалифицированной технической помощи по протоколам, описанным в этой работе. Кроме того, мы хотели бы признать наставничество Кристофер Б. Newgard в Университете Дьюка и Алан Д. Attie в Университете Висконсин-Мэдисон, наряду с поддержкой своих членов лабораторных, что позволило нам время и поддержку, необходимые для оптимизации описанные протоколы. В частности, мы благодарим Ганса Hohmeier, Даньхун Лу, и Хелена Уинфилд в Newgard лаборатории и Мэри Rabaglia в Attie лаборатории для продуктивных дискуссий и консультаций. Эта работа была поддержана NIH грант DK080845 и детского диабета 594
Фонд исследований грант 17-2011-608 (для MEK)
Materials
| Collagenase: Collagenase from Clostridium histolyticum suitable for isolating active islets | Sigma-Aldrich | C7657 |
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F9378 |
| Hanks Balanced Salt Solution 10X | Invitrogen (Gibco) | 14065-056 |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 |
| RPMI 1640 (powder) | Invitrogen (Gibco) | 31800-022 |
| Albumin from Bovine Serum (BSA) | Sigma-Aldrich | A7888 |
| 3/0 Silk Suture Thread | Fine Science Tools | 18020-30 |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 |
| 0.8 mm Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 |
| Curved Scissors | Fine Science Tools | 14061-10 |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors – Straight/Sharp/8.5 cm/5 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15003-08 |
| Dissecting Scissors | Fine Science Tools | 14002-14 |
| 5ml BD Luer-Lok Syringe | BD | 309646 |
| 1ml BD syringe | BD | 309628 |
| 30 G BD Needle 1/2" Length | BD | 305106 |
| 27 G BD Needle 1/2" Length | BD | 305109 |
| Sharpening Stone | Fine Science Tools | 29008-01 |
| 2-2-2 tribromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402-25G |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 240486-100mL |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 |
| Monopotassium Phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P0662 |
| Sodium Bicarbonate (NaCHO3) | Sigma-Aldrich | S6014 |
| CaCl2 *2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 |
| MgSO4 *7H2O | Sigma-Aldrich | M9397 |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen (Gibco) | 15140-122 |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum (H.I. FBS) | Fisher Scientific | SH30088.03HI |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma-Aldrich | 5879-100MG |
References
- Cryer, P. E. Hypoglycaemia: the limiting factor in the glycaemic management of Type I and Type II diabetes. Diabetologia. 45, 937-948 (2002).
- Alberti, K. G., Zimmet, P. Z. Definition, diagnosis and classification of diabetes mellitus and its complications. Part 1: diagnosis and classification of diabetes mellitus provisional report of a WHO consultation. Diabet Med. 15, 539-553 (1998).
- Muoio, D. M., Newgard, C. B. Mechanisms of disease: molecular and metabolic mechanisms of insulin resistance and beta-cell failure in type 2 diabetes. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 193-205 (2008).
- Kelly, C., McClenaghan, N. H., Flatt, P. R. Role of islet structure and cellular interactions in the control of insulin secretion. Islets. 3, 41-47 (2011).
- Meda, P., Halban, P., Perrelet, A., Renold, A. E., Orci, L. Gap junction development is correlated with insulin content in the pancreatic B cell. Science. 209, 1026-1028 (1980).
- Hohmeier, H. E., et al. Isolation of INS-1-derived cell lines with robust ATP-sensitive K+ channel-dependent and -independent glucose-stimulated insulin secretion. Diabetes. 49, 424-430 (2000).
- Hohmeier, H. E., Newgard, C. B. Cell lines derived from pancreatic islets. Mol Cell Endocrinol. 228, 121-128 (2004).
- Field, J. B. Extraction of insulin by liver. Annu Rev Med. 24, 309-314 (1973).
- Emmanouel, D. S., et al. Glucagon metabolism in the rat. J Clin Invest. 62, 6-13 (1978).
- Kimple, M. E., et al. Deletion of GalphaZ protein protects against diet-induced glucose intolerance via expansion of beta-cell mass. J Biol Chem. 287, 20344-20355 (2012).
- Rabaglia, M. E., et al. Alpha-Ketoisocaproate-induced hypersecretion of insulin by islets from diabetes-susceptible mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 289, 218-224 (2005).
- Collins, S. C., Salehi, A., Eliasson, L., Olofsson, C. S., Rorsman, P. Long-term exposure of mouse pancreatic islets to oleate or palmitate results in reduced glucose induced somatostatin and oversecretion of glucagon. Diabetologia. 51, 1689-1693 (2008).
- Fueger, P. T., Hernandez, A. M., Chen, Y. C., Colvin, E. S. Assessing Replication and Beta Cell Function in Adenovirally-transduced Isolated Rodent Islets. J Vis Exp. , (2012).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. J Vis Exp. , (2007).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Transplantation of pancreatic islets into the kidney capsule of diabetic mice. J Vis Exp. , (2007).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. J Vis Exp. , (2011).
- Kimple, M. E., et al. A role for G(z) in pancreatic islet beta-cell biology. J Biol Chem. 280, 31708-31713 (2005).
- Shaw, J. E., Sicree, R. A., Zimmet, P. Z. Global estimates of the prevalence of diabetes for 2010 and 2030. Diabetes Res Clin Pract. 87, 4-14 (2010).
- Kirstetter, P., Lagneau, F., Lucas, O., Krupa, Y., Marty, J. Role of endothelium in the modulation of isoflurane-induced vasodilatation in rat thoracic aorta. Br J Anaesth. 79, 84-87 (1997).
- Brown, E. T., Umino, Y., Loi, T., Solessio, E., Barlow, R. Anesthesia can cause sustained hyperglycemia in C57/BL6J mice. Vis Neurosci. 22, 615-618 (2005).
- Vaupel, D. B., McCoun, D., Cone, E. J. Phencyclidine analogs and precursors: rotarod and lethal dose studies in the mouse. J Pharmacol Exp Ther. 230, 20-27 (1984).
- Davis, D. B., et al. FoxM1 is up-regulated by obesity and stimulates beta-cell proliferation. Mol Endocrinol. 24, 1822-1834 (2010).
- Dionne, K. E., Colton, C. K., Yarmush, M. L. Effect of hypoxia on insulin secretion by isolated rat and canine islets of Langerhans. Diabetes. 42, 12-21 (1993).
- Linetsky, E., et al. Improved human islet isolation using a new enzyme blend, liberase. Diabetes. 46, 1120-1123 (1997).
- Vaithilingam, V., Sundaram, G., Tuch, B. E. Islet cell transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 13, 633-638 (2008).
- Brandhorst, H., et al. Large-scale comparison of Liberase HI and collagenase NB1 utilized for human islet isolation. Cell Transplant. 19, 3-8 (2010).
